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经典案例

来源：花匠小妙招时间：2024-09-02 20:35

近期，中国科学院上海辰山植物科学研究中心在Horticulture Research上发表了研究成果，首次实现了黄芩的T2T无间隙基因组组装，通过对CYP450基因家族的全基因组鉴定，发现了参与类黄酮修饰的新基因。

文章题目

Gap-free genome assembly and CYP450 gene family analysis reveal the biosynthesis of anthocyanins in Scutellaria baicalensis

第一作者：Tianlin Pei, Sanming Zhu

通讯作者：Mengying Cui, Qing Zhao

通讯单位：中国科学院上海辰山植物科学研究中心

杂志：Horticulture Research

影响因子：8.7/Q1

文章链接：

https://doi.org/10.1093/hr/uhad235

研究背景

黄芩(Scutellaria baicalensis Georgi)是一种多年生草本植物，原产于中国、蒙古、日本、俄罗斯和朝鲜半岛等地区。该植物属于唇形科，在中药中具有悠久的应用历史，用于腹泻、痢疾、高血压和炎症等多种疾病治疗，现代药理学研究已证实其具有潜在的神经和肝脏保护作用，以及抗菌、抗炎、抗氧化、抗病毒和抗肿瘤活性。黄芩含有丰富的黄酮类化合物，其B环上缺少一个4'-OH基团，这与经典4'-羟基黄酮类化合物不同。近年来，许多研究致力于探索黄芩素和汉黄芩素合成及其修饰的关键基因生化作用和进化轨迹。

花青素属于类黄酮的一个亚群，负责花着色以及植物的生物/非生物抗性，黄芩花瓣呈现蓝色到紫色，这是由于大量飞燕草素和矢车菊素类型花青素的积累。这两类花青素在B环都有3′-或3′5′-羟基。花青素是由经典类黄酮生物合成途径合成的，该途径始于苯丙氨酸。

细胞色素P450(CYP450)作为酶超家族，可催化原子单氧生成酮、醇和环氧化物等化合物。植物CYP450在黄酮类化合物(CYP75和CYP93)、萜类化合物(CYP76和CYP706)和生物碱(CYP80和CYP719)等特殊代谢产物的生物合成中起着至关重要的作用。利用高质量的基因组组装，越来越多的全基因组分析已经在许多植物中展开，包括水稻、大豆和拟南芥。在黄芩中，有几个CYP450基因已被功能鉴定，包括两个基因CYP93B24和CYP93B25，分别编码FNSII-1和FNSII-2。还有两种CYP82D酶分别作为F6H和F8H参与黄芩素和汉黄芩素的合成。然而，对黄芩中CYP450家族和黄酮B环羟基化相关基因的全基因组研究尚未见报道。

技术方案

Pacbio HiFi➕ONT➕Hi-C技术

比较基因组分析

代谢组分析

系统发育分析

酵母酶活测定

研究意义

研究首次报道了黄芩属植物的无间隙基因组及其花朵中主要黄酮类化合物的鉴定和定量，还对黄芩中的CYP450基因家族进行了深入分析，并对SbFBHs进行了功能测试。这些工作为黄酮类化合物B环的羟基化提供了新的见解，也为其代谢工程提供了新的候选基因，为培育园艺领域蓝花种质奠定了更丰富的理论基础，并通过合成生物学为蓝色花青素的生物合成提供了新的视角。

▲黄芩T2T无间隙基因组组装及其基因组特征

研究人员利用Pacbio HiFi、ONT和Hi-C技术对黄芩进行综合测序，填补所有空白并用HiFi reads校正错误后，最终得到的无间隙黄芩基因组大小为384.59Mb，contig N50为42.44Mb，所有的contigs都锚定在9条假染色体中。通过将Hi-C相互作用热图与大空白区域、低基因密度区和高LTR/Gypsy密度区相结合，成功地鉴定了除Chr7外的每条染色体的一个潜在着丝粒，这些假定着丝粒长度从0.81Mb~4.95Mb不等，Chr7上存在两个区域难以确定真正的着丝粒，对着丝粒位置的确认还需要FISH和ChIP-seq等额外的实验进行验证。RNA测序数据库用于基因组注释，最终的注释共得到28,097个基因。黄芩基因组重复序列占65.11%，其中串联重复序列占0.05%，穿插重复序列占4.37%，最丰富的重复序列为LTRs，占基因组的26.08%。

与之前的基因组版本相比，在无间隙基因组的所有片段中都观察到了各种结构变异(SV)，包括倒位、易位和重复，这表明新的组装质量有所提高。在这些SVs中重复变异所占比例最大(89%)，主要集中在端粒和中心粒区域。对这些SV序列进行的GO和KEGG分析表明，大多数序列富集在防御反应中，如植物与病原体的相互作用和MAPK信号通路。通过PAV分析对新添加的片段进行了分类，GO和KEGG分析发现，大多数片段也富集在防御反应中，与KEGG通路中的植物激素信号转导相对应。

▲比较基因组分析

为了阐明黄芩的进化特征和基因家族，将黄芩基因组与14种已发表的植物基因组进行了比较，并将基础被子植物无油樟(Amborella trichopoda)作为外群进行了比较。基因家族聚类分析确定了16,272个基因家族，其中7035个在所有物种中普遍存在。在这些共有家族中，有100个是单拷贝基因家族。对黄芩、丹参、半枝莲和拟南芥进行了比较，共发现11,160个基因家族，黄芩特有基因家族2338个。与16种植物最近共同祖先(MRCA)相比，黄芩包括578个扩张基因家族(2148个基因)，930个收缩基因家族(1206个基因)。GO分析表明，扩增的基因富集在与“O-甲基转移酶活性”和“单氧化酶活性”相关的通路中，表明基因家族扩增在改变黄芩中特殊代谢物的生物合成方面发挥了作用，并可能解释了黄芩中由O-甲基转移酶和CYP450单氧化酶催化的O-甲基化和羟基化黄酮普遍存在的原因。

根据16个物种中290个单拷贝同源基因比对建立了系统发生树发现，番茄(Solanum lycopersicum)大约在104.9Mya从唇形目中分离出来，而芝麻(Sesamum indicum)大约在60.1Mya前从唇形科中分离出来。随后，黄芩属分别于距今约49.4和39.0Mya前从丹参鼠尾草属和柚木属中分化出来。这些发现支持了之前提出的系统发育顺序。

▲黄芩广泛靶向代谢分析

利用靶向代谢组方法对黄酮类化合物的积累模式进行了检测，结果发现黄芩花中含有498种黄酮类化合物，大多数都是糖基化的，其苷元通常为3′或3′5′羟基化。为了进一步分析花色，研究人员采用了基于花青素的广泛靶向代谢组研究来定量分析黄芩花中的花青素，共检测到93种靶向花青素化合物中的40种，飞燕草素和矢车菊素类型花青素是黄芩中积累的两种最主要的花青素。

▲黄芩和拟南芥CYP450系统发育树

通过HMM模型对黄芩无间隙基因组进行搜索，提取了260个CYP450酶，通过对这些酶与来自拟南芥的CYP450的系统进化分析，将它们聚类为44个亚科。为了确定基因的相对位置，研究了两个或更多基因位于同一染色体上八个ORF距离之内的基因簇，染色体位置显示，黄芩染色体上分布着49个基因簇，占全部CYP450基因的60%。基于系统进化树，鉴定出7个类黄酮B环羟化酶候选基因(SbFBH1-7)，属于CYP75亚家族。为了分析它们与来自不同物种的F3′H和F3′5′H的关系，我们利用SbFBH1-7和一些已报道的序列构建了系统发育树，结果表明，SbFBH7与葡萄中的F3′5′H(VvF3′5′H)同属CYP75A亚家族(典型F3'5'H)；SbFBH1、2和5与来自CYP75B亚家族(典型F3'5'H)的酶聚集在一起，包括来自拟南芥的F3′H(AtF3′H)和来自瓜叶菊属的F3′5′H(PcF3’5’H)，它们是CYP75A分支的姐妹群；SbFBH3、4和6形成了一个独立的亚群，与其他两个亚群明显分离，表明这些酶可能在羟基化过程中经历了新功能化。氨基酸序列相似性分析表明，CYP75B(SbFBH1、2和5)亚家族与来自CYP75A的SbFBH7具有较低的同源性；在CYP75A亚家族中，SbFBH1和SbFBH2序列同源性较高，但与SbFBH5同源性较低；SbFBH1和SbFBH2相邻位于假染色体1上，表明它们是具有相似功能的串联重复基因。

▲SbFBH基因的系统发育分析、多序列比对及表达模式

通过对黄芩不同组织的RNA-seq分析，发现SbFBH2、5和7在356株花和花蕾中均有较高的表达量，可能参与了花的色素沉着过程。SbFBH7在花蕾中的平均FPKM值分别是SbFBH2和5的22.16倍和16.63倍，表明SbFBH7是黄芩花显色的关键酶；SbFBH1和4的转录本在植物地上部分均有积累，而SbFBH3和6在叶片、根和茎中表达量较高；此外，SbFBH4、5和6的转录本在JA处理的根中上调，表明它们可能参与根中黄酮的羟基化过程。

为了进一步分析其酶功能，研究人员成功将SbFBHs的全长ORF构建到表达载体并转化到酵母中，用不同底物对菌株进行发酵。发现二氢槲皮素和二氢杨梅素分别是矢车菊素型和飞燕素型花青素的前体，可能与黄芩花显色有关。结果表明，SbFBH1、2和5是参与花青素合成的F3′5′H, SbFBH7是参与花青素合成的F3′5′H，是蓝色观赏花卉基因工程的有力候选基因。