Preparation and catalytic properties of catalase
摘要:过氧化氢酶(catalase, CAT) 是一种在食品、医疗、纺织等领域广泛应用的工业酶,具有催化效率高、专一性强、绿色环保等突出特点。工业中游离过氧化氢酶无法回收再利用,导致以其为核心的工业生物转化过程成本较高。开发一种简单、温和、低成本并且体现绿色化学理念的方法对过氧化氢酶进行固定化有望提高其利用率并且强化酶学性能,具有迫切的现实需求。本研究将源自枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis) 168的过氧化氢酶KatA在大肠杆菌中进行重组表达,之后将分离纯化得到的纯酶以酶-无机杂化纳米花形式制备成固定化酶并进行酶学性质研究。结果显示,利用乙醇沉淀、DEAE阴离子交换层析、疏水层析3步纯化,最终获得电泳纯的重组KatA,之后通过优化制备条件获得了一种新型KatA/Ca3(PO4)2杂化纳米花固定化酶。酶学性质研究结果显示,游离酶KatA的最适反应温度为35 ℃,KatA/Ca3(PO4)2杂化纳米花的最适反应温度为30−35 ℃,二者最适反应pH值均为11.0。游离酶KatA和KatA/Ca3(PO4)2杂化纳米花在pH 4.0−11.0和25−50 ℃条件下均表现出较好的稳定性。KatA/Ca3(PO4)2杂化纳米花显示出比游离酶KatA更好的储存稳定性,在4 ℃储存14 d后仍保留82%的酶活力,而游离酶仅具有50%的酶活力。此外,纳米花在进行5次催化反应后仍具有55%的酶活力,表明其具有较好的操作稳定性。动力学研究结果显示,游离酶KatA对底物过氧化氢的Km为(8.80±0.42) mmol/L,kcat/Km为(13 151.53±299.19) L/(mmol·s);而KatA/Ca3(PO4)2杂化纳米花的Km为(32.75±2.96) mmol/L,kcat/Km为(4 550.67±107.51) L/(mmol·s)。与游离酶KatA相比,KatA/Ca3(PO4)2杂化纳米花对底物过氧化氢的亲和力下降,同时其催化效率也有所降低。综上所述,本研究以Ca2+作为自组装诱导剂,成功将KatA以酶-无机杂化纳米花形式制备成固定化酶,不仅对部分酶学性能实现了强化,而且为固定化过氧化氢酶的绿色制备和规模化应用奠定了基础。
PANG Jiao , JIANG Mengtong , LIU Yuxin , LI Mingyu , SUN Jiaming , WANG Conggang , LI Xianzhen
Abstract: Catalase is widely used in the food, medical, and textile industries. It possesses exceptional properties including high catalytic efficiency, high specificity, and environmental friendliness. Free catalase cannot be recycled and reused in industry, resulting in a costly industrial biotransformation process if catalase is used as a core ingredient. Developing a simple, mild, cost-effective, and environmentally friendly approach to immobilize catalase is anticipated to improve its utilization efficiency and enzymatic performance. In this study, the catalase KatA derived from Bacillus subtilis 168 was expressed in Escherichia coli. Following separation and purification, the purified enzyme was prepared as an immobilized enzyme in the form of enzyme-inorganic hybrid nanoflowers, and the enzymatic properties were investigated. The results indicated that the purified KatA was obtained through a three-step procedure that included ethanol precipitation, DEAE anion exchange chromatography, and hydrophobic chromatography. Then, by optimizing the process parameters, a novel KatA/Ca3(PO4)2 hybrid nanoflower was developed. The optimum reaction temperature of the free KatA was determined to be 35 ℃, the optimum reaction temperature of KatA/Ca3(PO4)2 hybrid nanoflowers was 30−35 ℃, and the optimum reaction pH of both was 11.0. The free KatA and KatA/Ca3(PO4)2 hybrid nanoflowers exhibited excellent stability at pH 4.0−11.0 and 25−50 ℃. The KatA/Ca3(PO4)2 hybrid nanoflowers demonstrated increased storage stability than that of the free KatA, maintaining 82% of the original enzymatic activity after 14 d of storage at 4 ℃, whereas the free KatA has only 50% of the original enzymatic activity. In addition, after 5 catalytic reactions, the nanoflower still maintained 55% of its initial enzymatic activity, indicating that it has good operational stability. The Km of the free KatA to the substrate hydrogen peroxide was (8.80±0.42) mmol/L, and the kcat/Km was (13 151.53± 299.19) L/(mmol·s). The Km of the KatA/Ca3(PO4)2 hybrid nanoflowers was (32.75±2.96) mmol/L, and the kcat/Km was (4 550.67±107.51) L/(mmol·s). Compared to the free KatA, the affinity of KatA/Ca3(PO4)2 hybrid nanoflowers to the substrate hydrogen peroxide was decreased, and the catalytic efficiency was also decreased. In summary, this study developed KatA/Ca3(PO4)2 hybrid nanoflowers using Ca2+ as a self-assembly inducer, which enhanced the enzymatic properties and will facilitate the environmentally friendly preparation and widespread application of immobilized catalase.
Keywords: catalase immobilized enzymes organic-inorganic hybrid nanoflowers enzymatic properties
过氧化氢酶(catalase,简称CAT, EC 1.11.1.6) 一种重要的工业酶,能催化过氧化氢分解为水和氧气,在食品、医疗、纺织、环保等领域具有重要的应用[1-3]。如在食品烘烤过程中,常同时添加过氧化氢和CAT用作食品疏松剂。在异麦芽低聚糖的制备过程中添加葡萄糖氧化酶和CAT可以促进产物的提纯[4-5];在医疗领域中,CAT可用于分解隐形眼镜消毒液中残留的过氧化氢(H2O2)[6];在纺织工业中,CAT可替代传统化学法去除漂白工艺中残留的H2O2,既可降低生产成本,又具备绿色环保的优势[7];在环保工业中,用CAT降解工业废水中残留的H2O2可以避免化学法处理带来的二次污染[8]。由于CAT在上述领域的应用势头迅猛,导致目前市场对CAT的需求量逐年增加。然而,以游离态存在的商品化CAT无法重复利用,并且稳定性不足,导致以CAT为核心的工业生物催化及相关保存运输过程成本较高。
利用特定技术将生物酶固载于水不溶性载体材料上,从而制备成固定化酶是一种有效提高酶的利用率和稳定性的策略。然而,固定化技术对生物酶的改造效果受多方面因素的影响,如固定化载体、反应介质、酶分子性质等。对于不同的生物酶缺少普适性的固定化策略,需要根据酶的自身特性以及应用需求来选择合适的固定化方法[9]。目前针对CAT的固定化研究工作已经取得了一些进展[10]。现有CAT的固定化方法主要集中于利用吸附法、包埋法、交联法和共价结合法等传统方法对其进行固载[11],如Alptekin等将牛肝来源的CAT通过共价结合法固定在Eupergit C载体上,制备的固定化CAT不仅热稳定性相比游离CAT有所改善,而且储存稳定性显著提高,在5 ℃下保存28 d后酶活力为初始酶活力的79%,而游离CAT在储存11 d后完全失活[12]。陈爽等将CAT通过戊二醛交联法固载于Fe(Ⅲ) 改性的胶原纤维,得到的固定化CAT与游离酶的最适反应温度和pH相同,比活力有所降低,但热稳定性显著提高,在75 ℃保存5 h后,仍能保留30%的活力[13]。厉成宣等以高碘酸钠氧化棉织物为载体固定化CAT,发现固定化CAT在偏酸性环境下稳定性较游离酶差,但在偏碱性环境下稳定性比游离酶好[14]。因此,目前通过传统方法固定化CAT虽然提高了利用率,但需要额外的载体材料和固载用化学试剂,导致固定化酶制备成本和后续化学试剂的处理成本较高,对环境保护治理造成了额外的负担。因此,亟需针对CAT固定化酶的绿色制备和高效利用开发新的固定化策略[12, 15]。
近年来,将生物酶以有机-无机杂化纳米花形式制备成固定化酶受到了广泛关注,其具有制备成本低、过程简单、有利于酶固载后保留功能活性、体现绿色化学理念有利于可持续发展等突出优势。纳米花的形成主要是利用生物酶、金属阳离子与磷酸根阴离子通过自组装形成具有类似天然花卉形态结构的复合体。在固定化过程中,生物酶和金属离子分别作为有机组分和无机组分进行杂化[16],仅需向含有目的蛋白的磷酸盐缓冲液中加入特定金属离子溶液并进行孵育即可制备出纳米花形式的固定化酶[17]。自2012年Ge等首次制备了蛋白质-Cu3(PO4)2杂化纳米花以来[18],该技术的应用越发广泛。目前纳米花在生物催化、传感器制备、生物医药等领域展现出较大的应用潜力[19-20]。Zare等将漆酶制备成纳米花,相比游离酶表现出更好的催化活性和稳定性[18]。Cui等制备了脂肪酶-磷酸铜杂化纳米花,具有相比游离酶更好的催化活性和稳定性[21]。此外,有研究报道已成功将葡萄糖氧化酶、α-淀粉酶和脲酶等多种生物酶制备成为酶-无机杂化纳米花[22-24]。上述研究进展表明,将生物酶制备成纳米花不仅能够实现重复利用,而且普遍表现出相比游离酶更好的稳定性和催化活性。由于与游离酶或传统方法制备的固定化酶相比,很多单酶或多酶复合杂化纳米花表现出更高的催化活性和稳定性,因此利用有机-无机杂化纳米花制备技术对CAT进行固定化有望为CAT的高效制备和利用提供新策略。然而,目前对CAT以纳米花形式进行固定化的工作处于起步阶段,且采用牛肝来源的CAT导致制备成本较高。如Zhang等制备了一种过氧化氢酶-磷酸铜杂化纳米花,并且将其成功用于构建H2O2的可视化检测平台[25]。
本文前期工作中将源自枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis) 168的过氧化氢酶KatA在多种微生物宿主中进行了重组表达和酶学性质研究,发现该酶具有优良的酶学性质[26-28]。因此,为提高KatA的利用率和稳定性以成功实现其规模化应用,本研究将KatA在大肠杆菌(Escherichia coli) BL21(DE3) 中进行重组表达和分离纯化,将纯酶制备成酶-无机杂化纳米花形式的固定化酶。对影响纳米花活性的关键参数如金属离子类型和浓度、孵育时间、孵育温度进行了优化。之后将优选的KatA-Ca3(PO4)2纳米花进行形态表征和酶学性质研究,从而为固定化过氧化氢酶的绿色制备和高效利用提供新策略,促进过氧化氢酶在工业上的规模化应用。
1 材料与方法1.1 材料和试剂1.1.1 菌株和质粒
菌株大肠杆菌(Escherichia coli) DH10B、BL21(DE3) 均为本实验室保存,质粒pET22b-katA由苏州泓迅生物科技股份有限公司合成。
1.1.2 主要试剂
氨苄青霉素(ampicillin, Amp)、异丙基- β-d-硫代吡喃半乳糖苷(isopropyl-β-d- thiogalactoside, IPTG)、二辛可宁酸(bicinchonininc acid, BCA) 蛋白质定量检测试剂盒购自生工生物工程(上海) 股份有限公司。蛋白质相对分子质量标准品购自宝生物工程(大连) 有限公司。DEAE Sepharose Fast Flow阴离子交换层析填料、Phenyl SepharoseTM CL-4B疏水层析填料均购自通用电气(中国) 有限公司。其他化学试剂购自天津市科密欧化学试剂有限公司。
1.1.3 培养基
LB液体培养基:胰蛋白胨10 g/L,酵母浸粉5 g/L,NaCl 10 g/L,pH为7.25。LB固体培养基为在LB液体培养基中加入终浓度为1.5%的琼脂。TB培养基:胰蛋白胨12 g/L,酵母浸粉24 g/L,4%甘油,170 mmol/L KH2PO4,720 mmol/L K2HPO4,pH为7.25。10 mmol/L磷酸缓冲盐溶液(phosphate buffered saline, PBS) (g/L, pH为7.4):NaCl 8,KCl 0.2,Na2HPO4 1.44,KH2PO4 0.28。缓冲液A:Na2HPO4- NaH2PO4 50 mmol/L,pH为7.0。
1.2 主要仪器
Milli-Q超纯水过滤系统、Cogent μScale TFF System,Millipore公司;HITACHI-CR21GIII超速冷冻离心机,日立(中国) 有限公司;TGL-16高速台式冷冻离心机,湘仪离心机仪器有限公司;通用型垂直电泳仪,生工生物工程(上海) 股份有限公司;Infinite F50酶标仪,TECAN公司;PCR仪,Eppendorf公司;NanoVue plus超微量紫外分光光度计、ImageQuant LAS4000凝胶成像分析系统,通用电气(中国) 有限公司;AKTA蛋白纯化仪,GE公司;紫外分光光度计,上海元析仪器有限公司;真空干燥箱,上海一恒科学仪器有限公司;扫描电镜系统,电子株式会社。
1.3 重组工程菌的诱导表达
将重组工程菌E. coli BL21(DE3)-pET22b- katA在LB固体平板划线培养,挑取单菌落接种于5 mL含100 μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中,37 ℃、200 r/min培养14 h得到种子液。将种子液以2% (V/V) 比例转入含100 μg/mL氨苄青霉素的TB培养基中进行扩大培养,在37 ℃、200 r/min条件下培养至菌体OD600达到0.6−0.8时,加入终浓度为0.1 mmol/L的IPTG,在16 ℃、200 r/min条件下培养20 h进行诱导表达。
1.4 KatA的分离纯化
将重组工程菌E. coli BL21(DE3)-pET22b- katA诱导表达后的发酵液在4 ℃、10 000 r/min离心10 min收集菌体细胞。参考文献[29]中的方法,利用含有精氨酸的缓冲液提取周质空间蛋白。先使用10倍体积的0.4 mol/L的精氨酸缓冲液(pH 8.0) 重悬菌体细胞,置于冰水混合物中孵育45 min,随后在10 000 r/min离心10 min后收集上清液为周质空间蛋白样品。将周质空间蛋白样品在冰水混合物中充分预冷后,缓慢加入预冷的乙醇至总体积的80%,继续在冰水混合物中静置45 min后于10 000 r/min离心30 min得到含有KatA的沉淀组分。之后将乙醇沉淀组分利用缓冲液A复溶,将复溶后样品于10 000 r/min条件下离心30 min,去除未溶解的沉淀后利用色谱技术纯化KatA。将乙醇沉淀复溶后样品上样于DEAE阴离子交换层析柱,首先用10倍柱体积的缓冲液A充分清洗色谱柱以除去未结合的杂蛋白,之后用含有0−1 mol/L NaCl的缓冲液A进行线性梯度洗脱。将洗脱样品中含有目的蛋白KatA的组分收集合并后进行透析以去除NaCl。之后向含有KatA的样品中加入等体积的含2 mol/L (NH4)2SO4的缓冲液A,10 000 r/min条件下离心40 min去除不溶性沉淀,之后上样于Phenyl SepharoseTM CL-4B疏水层析柱,利用含1 mol/L (NH4)2SO4的缓冲液A清洗层析柱以除去未结合的杂蛋白,之后利用含0−1 mol/L (NH4)2SO4的缓冲液A进行线性梯度洗脱,将含有目的蛋白的组分收集合并后利用10 mmol/L PBS缓冲液进行透析并利用超滤进行浓缩。利用12%的SDS-PAGE对蛋白样品进行检测。利用BCA法对纯酶进行定量检测。
1.5 过氧化氢酶KatA-无机杂化纳米花的制备和表征1.5.1 纳米花的制备
KatA-Ca3(PO4)2纳米花:取5 mL用10 mmol/L PBS溶液稀释为0.2 mg/mL的KatA纯酶,加入80 μL浓度为200 mmol/L的CaCl2溶液,混匀后静置反应不同时间后,12 000 r/min离心10 min收集沉淀并用ddH2O洗涤3次后,用真空干燥箱于25 ℃干燥后储存;KatA- Cu3(PO4)2纳米花:取5 mL用10 mmol/L PBS溶液稀释为0.2 mg/mL的KatA纯酶,加入234 μL浓度为120 mmol/L的无水硫酸铜溶液,混匀后静置反应不同时间后,12 000 r/min条件下离心10 min收集沉淀并用ddH2O洗涤3次后,用真空干燥箱于25 ℃干燥后储存;KatA-Zn3(PO4)2纳米花:取5 mL用10 mmol/L PBS溶液稀释为0.2 mg/mL的KatA纯酶,加入400 μL浓度为0.05 g/mL的乙酸锌溶液,混匀后静置反应不同时间后,12 000 r/min条件下离心10 min收集沉淀并用ddH2O洗涤3次后,用真空干燥箱于25 ℃干燥后储存。
1.5.2 Ca2+浓度优化
针对KatA-Ca3(PO4)2纳米花,将KatA纯酶用10 mmol/L PBS溶液稀释为0.2 mg/mL,之后取5 mL稀释后纯酶分别加入80 μL浓度为200、250、300 mmol/L的CaCl2溶液,充分混匀后静置反应24 h,之后按1.5.1所述方法收集纳米花。
1.5.3 制备时间优化
针对KatA-Ca3(PO4)2纳米花,将KatA纯酶用10 mmol/L PBS溶液稀释为0.2 mg/mL,之后取5 mL稀释后纯酶加入80 μL浓度为200 mmol/L的CaCl2溶液,充分混匀后静置反应24、48、72 h并取样按1.5.1所述方法收集纳米花。
1.5.4 制备温度优化
针对KatA-Ca3(PO4)2纳米花,将KatA纯酶用10 mmol/L PBS溶液稀释为0.2 mg/mL,之后取5 mL稀释后纯酶加入80 μL浓度为300 mmol/L的CaCl2溶液,充分混匀后分别在4 ℃和25 ℃静置反应48 h,之后按1.5.1所述方法收集纳米花。
1.6 纳米花的形态结构表征
收集经真空干燥的KatA-Ca3(PO4)2纳米花样品,用导电胶固定在导电台上,并对其进行喷金处理后,在20 kV的加速电压下,通过扫描电子显微镜(scanning electron microscope, SEM) 观察其形貌及结构特征。
1.7 酶活力的测定
利用分光光度法分别检测游离酶和纳米花的酶活力[30],将0.1 mL游离酶或纳米花溶液分别加入0.9 mL含10 mmol/L H2O2的50 mmol/L Na2HPO4-NaH2PO4缓冲液(pH 7.0),于37 ℃反应2 min,测定240 nm处吸光度的变化并计算酶活力。酶活力单位的定义为:37 ℃下每分钟分解1 μmol H2O2所需的酶量为一个酶活力单位。
1.8 游离酶KatA和KatA-Ca3(PO4)2纳米花的酶学性质表征1.8.1 最适反应pH和pH稳定性
最适反应pH的测定:将0.1 mL纯酶或纳米花溶液分别加入0.9 mL含10 mmol/L H2O2的不同pH (pH 4.0−6.0 Na2HPO4-C6H8O7;pH 6.0−8.0 Na2HPO4-NaH2PO4;pH 8.0−9.0 Tris- HCl;pH 9.0−10.0 Na2CO3-NaHCO3;pH 10.0− 11.0 NaHCO3-NaOH;pH 11.0−12.0 Na2HPO4- NaOH) 缓冲液中,于37 ℃反应2 min测定酶活力,以最高酶活力值作为100%。pH稳定性的测定:将纯酶或纳米花溶液分别在pH 4.0− 12.0不同缓冲液中孵育30 min后在最适反应条件下检测酶活力,以最高酶活力值作为100%。
1.8.2 最适反应温度和温度稳定性
最适反应温度的测定:取0.1 mL纯酶或纳米花溶液加入0.9 mL含10 mmol/L H2O2的pH 11.0的NaHCO3-NaOH缓冲液中,分别在25 ℃、30 ℃、35 ℃、40 ℃、45 ℃、50 ℃、55 ℃、60 ℃、65 ℃、70 ℃下反应2 min测定酶活力,以最高酶活力值为100%。温度稳定性的测定:将纯酶或纳米花溶液分别在25−70 ℃条件下孵育30 min,之后迅速冰浴冷却后于最适反应条件下测定酶活力,以最高酶活力值作为100%。
1.8.3 动力学常数的测定
将纯酶或纳米花分别在最适反应条件下,于不同浓度过氧化氢底物(2.5、4、5、8、10、20、30、40、50、60、70、80 mmol/L) 中进行催化反应并计算反应初速度,利用GraphPad Prism5.0基于Michaelis-Menten方程进行非线性拟合得到动力学参数Km、Vmax并计算得到kcat、kcat/Km。
1.8.4 储存稳定性
将纯酶和纳米花分别在50 mmol/L的Na2HPO4-NaH2PO4缓冲液(pH 7.0) 中于4 ℃储存。在不同时间点取样测定酶活力,以初始酶活力值作为100%。
1.8.5 操作稳定性
将KatA-Ca3(PO4)2纳米花连续进行5次催化反应,每次反应结束后于6 000 r/min离心收集纳米花,并用10 mmol/L PBS缓冲液(pH 7.0) 清洗一次,按照1.7的方法测定酶活力,以初始酶活力值作为100%。
2 结果与分析2.1 重组KatA的诱导表达与分离纯化
将工程菌E. coli BL21(DE3)-pET22b-katA进行摇瓶培养并在16 ℃以0.1 mmol/L终浓度的IPTG进行诱导表达。提取周质空间蛋白混合物后,依次通过乙醇沉淀、DEAE离子交换层析、疏水层析最终得到KatA纯酶。将纯化过程中各步骤所获蛋白样品利用SDS-PAGE检测,结果如图 1所示,经过分离纯化在约54.8 kDa处显示相应目的条带,表明成功纯化到过氧化氢酶KatA。

2.2 KatA-无机杂化纳米花的制备及条件优化2.2.1 纳米花的制备
有机-无机杂化纳米花由于具有制备条件温和、操作简单、比表面积大、酶活力高等优势,目前在酶固定化领域的应用越发广泛,其中Cu2+、Ca2+和Zn2+是应用较多的无机组分,已成功将漆酶、脂肪酶、脲酶等多种生物酶制备成酶-无机杂化纳米花[18, 21, 24]。因此分别选取Cu2+、Ca2+、Zn2+为无机组分,KatA为有机组分,探索了将二者进行杂化形成纳米花的可行性。首先对不同金属离子诱导KatA形成的纳米花进行酶活力检测,结果如图 2所示,KatA- Ca3(PO4)2纳米花具有最高酶活力,比活力达到5 234.8 U/mg,因此选择KatA-Ca3(PO4)2纳米花进行后续研究工作。

2.2.2 Ca2+浓度优化
对KatA-Ca3(PO4)2纳米花的制备条件进行优化,首先考察Ca2+浓度对KatA-Ca3(PO4)2纳米花酶活力的影响,分别在不同Ca2+浓度(200、250、300 mmol/L) 下制备纳米花并检测酶活力。结果如图 3所示,Ca2+浓度为200 mmol/L时形成的纳米花具有最高酶活力,因此后续选择200 mmol/L Ca2+浓度条件下制备的纳米花进行研究。

2.2.3 制备时间优化
进一步考察制备时间对KatA-Ca3(PO4)2纳米花酶活力的影响,将过氧化氢酶KatA与200 mmol/L浓度的Ca2+混合后,分别在25 ℃下孵育24、48、72 h制备纳米花,对不同时间(24、48、72 h) 条件下形成的纳米花进行酶活力检测,结果如图 4所示,静置48 h形成的纳米花具有最高酶活力,继续静置孵育到72 h的纳米花酶活力并未明显提高,因此选择48 h进行纳米花的制备。

2.2.4 制备温度优化
研究不同制备温度对产生的KatA- Ca3(PO4)2纳米花酶活力的影响。分别在4 ℃和25 ℃下制备并收集纳米花进行酶活力测定,结果如图 5所示,在4 ℃制备的纳米花活性明显高于25 ℃下制备的纳米花,因此选择4 ℃进行KatA-Ca3(PO4)2纳米花的制备。

2.3 KatA-Ca3(PO4)2纳米花的形态结构表征
为了对纳米花的微观形貌进行分析,采用SEM对不同Ca2+浓度(200、250、300 mmol/L) 条件下制备的KatA-Ca3(PO4)2纳米花进行表征,结果如图 6所示,SEM结果显示不同Ca2+浓度下均形成由大量片层包围的花卉状结构,纳米花的直径约为1 µm。此外,随着Ca2+浓度的提高,形成的纳米花中片层堆叠更加致密。由于较大的片层间空隙有利于传质,因此这一特点可能是200 mmol/L的Ca2+相比更高浓度下制备的纳米花具有更高的酶活力的主要原因。

2.4 游离酶KatA和KatA-Ca3(PO4)2纳米花的最适反应pH和pH稳定性
将游离酶KatA和KatA-Ca3(PO4)2纳米花进行酶学性质表征,首先在pH 4.0−12.0条件下检测二者的酶活力,结果如图 7A所示,二者的最适反应pH均为11.0,并且均在pH 4.0−12.0范围内具有酶活力。pH稳定性检测结果显示(图 7B),KatA-Ca3(PO4)2纳米花在pH 5.0−11.0范围内经过孵育后具有超过90%的酶活力,并且在pH 12.0下孵育后具有11%的酶活力。而游离酶KatA在pH 4.0−10.0下孵育30 min后具有超过84%的酶活力,在pH 11.0下孵育30 min后酶活力快速下降,尤其在pH 12.0下孵育30 min后酶活力仅剩3%,因此在碱性条件下纳米花显示出比游离酶KatA更好的稳定性。由于在食品、医药、纺织工业中,过氧化氢酶经常需要在碱性条件下使用,因此耐碱性更好的KatA-Ca3(PO4)2纳米花具有较好的应用潜力。

2.5 游离酶KatA和KatA-Ca3(PO4)2纳米花的最适反应温度和温度稳定性
将游离酶KatA和KatA-Ca3(PO4)2纳米花分别在25−70 ℃条件下进行催化反应以检测最适反应温度。结果如图 8A所示,纳米花的最适反应温度为30−35 ℃,而游离酶KatA的最适反应温度为35 ℃,说明纳米花在更宽的温度范围内表现出较好的酶活力。随后,在25−70 ℃范围进行温度稳定性检测,结果如图 8B所示,游离酶在25−50 ℃孵育30 min后保留超过92%的酶活力,而KatA-Ca3(PO4)2纳米花在同等处理条件下保留超过96%的酶活力。当孵育温度高于50 ℃后游离酶和纳米花的酶活力均迅速降低。

2.6 动力学常数的测定
在最适反应条件下分别测定游离酶KatA与KatA-Ca3(PO4)2纳米花对不同浓度底物过氧化氢的催化反应初速度并进行拟合得到动力学常数。结果如表 1所示,游离KatA的Km为(8.81± 0.42) mmol/L、Vmax为(4 438.00±74.28) µmol/(L·min)、kcat为(115 810.00±1 939.00) s−1,kcat/Km为(13 151.53±299.19) L/(mmol·s),而纳米花的Km为(32.75±2.96) mmol/L、Vmax为(29 535.67± 697.81) µmol/(L·min)、kcat为(149 034.55± 3 521.08) s−1,kcat/Km为(4 550.67±107.51) L/(mmol·s)。对比发现,KatA-Ca3(PO4)2纳米花的Km值较游离酶有所增加,表明固定化后KatA对底物过氧化氢的亲和力降低。这可能是由于包埋在纳米花中的KatA与纳米花片层材料之间的相互作用导致酶的构象发生变化,进而影响了酶对底物的可及性,以及底物在纳米花中的传质阻力增加影响了固定化后KatA对过氧化氢的结合[31]。此外,与游离酶相比,纳米花的kcat/Km值较游离酶降低,为游离酶的34%。
表 1 游离酶KatA及KatA-Ca3(PO4)2纳米花的动力学常数Table 1 Kinetic parameters of free enzyme KatA and KatA-Ca3(PO4)2 nanoflowers
Sample Km (mmol/L) Vmax (μmol/(L·min)) kcat (s−1) kcat/Km (L/(mmol·s)) Free KatA 8.81±0.42 4 438.00±74.28 115 810.00±1 939.00 13 151.53±299.19 Nanoflower 32.75±2.96 29 535.67±697.81 149 034.55±3 521.08 4 550.67±107.512.7 储存稳定性
储存稳定性是评价固定化酶性能的重要指标,因此将游离酶KatA与纳米花在4 ℃保存14 d,在不同时间点取样检测酶活力。结果如图 9所示,保存至14 d时,游离酶KatA仅剩50%的酶活力,而纳米花仍具有82%的酶活力,显示出比游离酶KatA更好的储存稳定性。纳米花具有更好储存稳定性的原因可能是由于纳米花独特的花卉状结构能够较好地保护KatA免受外界环境的干扰[32],因此以纳米花形式固定化KatA可以有效提高其储存稳定性,有利于其运输和长期储存。

2.8 KatA-Ca3(PO4)2纳米花的操作稳定性
相比游离酶,可重复利用是固定化酶的突出优势,有助于生物酶在工业中实现连续转化从而降低使用成本[33-35]。将KatA-Ca3(PO4)2纳米花连续进行5次催化反应检测酶活力,结果如图 10所示,经过1次催化反应后酶活力明显下降,但随后的催化循环中酶活力下降趋势明显变缓,纳米花经过5次催化反应后仍具有55%的酶活力。酶活力下降的可能原因是连续的催化反应中由于底物过氧化氢对纳米花的作用结合反复洗涤导致纳米花外层结合不牢固组分脱落,因此首次洗涤后酶活力下降较为明显,但余下的纳米花结构相对稳定并且可以继续进行催化。

3 讨论
固定化酶技术是酶工程领域的研究重点和热点。然而,已经成功实现产业化的固定化酶相对有限,仅葡萄糖异构酶、葡萄糖氧化酶、青霉素酰化酶等十几种生物酶被用于工业上大规模生产和应用。近年来新型固定化酶技术被不断开发,在食品、生物医学、环境保护等领域中显示出较好的应用潜力。其中,将酶与金属离子在磷酸盐缓冲液中共沉淀形成纳米花形式的固定化酶,具有制备成本低、操作简单、反应条件温和、绿色无污染等诸多优势,已经成功用于α-淀粉酶、脂肪酶、漆酶等生物酶的固定化,有效提高了上述酶的利用率和稳定性[18, 23, 36],而且有研究发现将糜蛋白酶、胰蛋白酶等制备成纳米花,酶活力较游离酶显著提高[37-38]。因此,本研究将具有较好应用潜力的源自枯草芽孢杆菌168的过氧化氢酶KatA在大肠杆菌BL21(DE3) 中进行重组表达,利用共沉淀法制备成酶-无机杂化纳米花。并且通过优化获得了具有较好稳定性和重复利用性的KatA- Ca3(PO4)2纳米花,证实了通过该方法能够将KatA制备成具有较好稳定性和重复利用性的固定化酶,也为进一步制备条件的精细设计优化和应用过程强化打下了基础。
目前商品化CAT以游离态存在,无法重复利用且稳定性不足,导致CAT相关工业生物催化和保存运输成本较高。将CAT制备成固定化酶有望突破相关技术瓶颈,具有迫切的现实需求。已报道对CAT进行固定化的研究工作主要采用传统方法对其进行固载,需要额外的载体材料和固载用化学试剂,并且步骤较多,不利于固定化CAT的规模化制备。如利用明胶为载体,戊二醛为交联剂将CAT进行固定化,制备的固定化酶在高温下具有更好的稳定性,同时催化效率有所降低[39]。Inanan利用甲基丙烯酸羟乙酯-壳聚糖高分子聚合物固定化CAT,最适反应温度从37 ℃下降为25 ℃,但最适反应pH未发生变化,同时在4 ℃下保存15 d仍具有82.1%的酶活力,而游离酶完全失活[40]。与上述固定化方法相比,应用纳米花技术固定化CAT制备过程简单、无需使用载体材料和偶联用化学试剂,在制备成本和环保方面具有明显优势。
尽管本研究成功制备出KatA-Ca3(PO4)2纳米花,并且表现出较好的稳定性和重复利用性,但其酶学性能仍有进一步提高的空间。本研究制备的KatA-Ca3(PO4)2纳米花对底物过氧化氢的Km值较游离态KatA有所增加,并且kcat/Km值降低到游离态KatA的34%,表明以纳米花形式固定化KatA导致对底物的亲和力和催化效率均有所降低。这一现象在其他研究工作中也有报道,如嗜热脂肪酶-铜杂化纳米花与游离酶相比对底物的亲和力有所降低[41]。由于酶固定化后,与载体的相互作用容易导致酶活性中心或重要调节部位的构象发生变化,此外底物在载体材料内部空隙中的传质阻力也会影响底物与酶活性中心的结合和催化,从而影响酶的催化特性。因此,尽管ω-转氨酶[42]、l-阿拉伯糖异构酶[43]、木瓜蛋白酶[44]等多种生物酶采用纳米花形式进行固定化后不仅具有较好的稳定性和重复利用性,而且催化效率相比游离酶也有所提高,但仍有很多酶,如碳酸酐酶[45]、脂肪酶[46]和磷酸三酯酶[47]等在采用纳米花形式固定化后,催化效率有所降低。此外,本研究中发现KatA-Ca3(PO4)2纳米花在重复催化过程中,酶活力有明显下降,表明在重复催化过程中,与底物的相互作用可能对纳米花载体和KatA产生影响。因此未来需要对不同金属离子诱导生物酶组装形成纳米花过程中的行为和机制进行解析,以强化酶-无机杂化纳米花的细节性设计,从而更加理性地提高纳米花的酶学性能并且实现过程强化。同时,未来可以针对KatA进行进一步地分子改造,提高其相关催化性能并且对其进行固定化从而强化固定化过氧化氢酶的使用性能。此外,提高KatA的表达量,进而实现一步利用粗酶液进行固定化,将有望进一步降低KatA固定化酶的制备成本。
综上所述,本文对源自枯草芽孢杆菌168的过氧化氢酶KatA的重组表达和固定化研究中,成功制备了具有较好稳定性和重复利用性的KatA-Ca3(PO4)2纳米花,不仅为低成本、绿色、高效制备固定化过氧化氢酶提供了新策略,而且拓展了纳米花的适用范围,为进一步精细设计和性能强化奠定了基础,有利于固定化过氧化氢酶的绿色高效制备和在工业上的大规模应用。
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张玉梅
网址: Preparation and catalytic properties of catalase https://www.huajiangbk.com/newsview79443.html
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