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花叶性状在油菜杂交种纯度控制中的应用

来源：花匠小妙招时间：2024-11-25 11:53

引用本文

倪西源, 黄吉祥, 柳寒, 潘兵, 赵坚义. 花叶性状在油菜杂交种纯度控制中的应用[J].核农学报, 2017,31(6): 1070-1075
NI Xiyuan, HUANG Jixiang, LIU Han, PAN Bing, ZHAO Jianyi. Application of Lobed-leaf Trait in Controlling Hybrid Purity of Rapeseed[J].JOURNAL OF NUCLEAR AGRICULTURAL SCIENCES,2017,31(6): 1070-1075

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《核农学报》编辑部所有

1 浙江省农业科学院作物与核技术利用研究所/植物有害生物防控国家重点实验室省部共建培育基地,浙江杭州 310021

2 浙江大学农业与生物技术学院作物科学研究所,浙江杭州 310029

通讯作者:赵坚义,女,研究员,主要从事油菜遗传和分子育种研究。E-mail:2208086097@qq.com

作者简介:倪西源,男,助理研究员,主要从事油菜遗传和分子育种研究。 E-mail:nixiyuan@yeah.net

收稿日期:2016-05-09接受日期:2016-09-23网络出版日期:2017-06-10

基金:

国家重点研发计划项目(2016YFD0101300),浙江省农业新品种选育重大科技专项(2016C02050-8),浙江省植物有害生物防控重点实验室—省部共建国家重点实验室培育基地基金(2010DS700124-KF1506, 2015-cxzt-05)

1 State Key Laboratory Breeding Base for Zhejiang Sustainable Pest and Disease Control/Institute of Crop and Nuclear Technology Utilization,Zhejiang Academy of Agricultural Sciences, Hangzhou, Zhejiang 310021

2 Institute of Crop Science, College of Agriculture and Biotechnology, Zhejiang University, Hangzhou, Zhejiang 310029

Keyword: Brassica; napus;L.,;morphological;marker,;lobed-leaf,;recessive;epistatic;genic;male;sterile,;hybrid;purity

我国是第一个大面积应用杂交油菜的国家, 杂交油菜种植面积占油菜总种植面积的比例已经超过70%, 杂交油菜的推广和应用在我国油菜生产的发展过程中发挥了重要作用[1]。细胞质雄性不育(cytoplasmic male sterility, CMS)和细胞核雄性不育(genic male sterility, GMS)是甘蓝型油菜杂种优势利用的主要途径。与CMS不育系统相比, 甘蓝型油菜的GMS不育系统具有不育彻底、恢复源广、可避免不育胞质负效应以及胞质单一化潜在的风险等优点[2, 3]。在油菜诸多类型的GMS中, 隐性上位互作核不育可以产生全不育系, 并采用两型系、临保系和恢复系的三系利用模式, 是目前应用最为广泛的一类GMS不育系统[4, 5, 6, 7, 8]。

在甘蓝型油菜隐性上位互作核不育的三系利用模式中, 两型系的繁殖、全不育系的配制以及杂交种的生产均需要通过杂交进行, 需要严格的隔离条件; 但在实际生产中由于隔离条件的限制, 杂交过程易受外来花粉源的污染, 最终造成杂交种纯度的降低。研究表明, 油菜细胞质雄性不育三系杂交种和隐性核不育两系杂交种的产量随纯度的降低而明显下降[9, 10]。因此, 油菜杂交种纯度不仅会影响其产量潜力的发挥, 还关系到生产用种的安全。

甘蓝型油菜的叶型可以分为花叶型、半花叶型和圆叶型3类, 现有的油菜品种多为半花叶型或圆叶型[11]。花叶性状具有早表现、易识别、表现期长且稳定的特点, 是一个理想的形态标记[12]。通过选育花叶不育系[13]或花叶恢复系[14]来配制杂交组合, 可在苗期利用花叶作为形态标记鉴定杂种的纯度。为了提高甘蓝型油菜隐性上位互作核不育杂交种的纯度, 本研究将花叶性状转入到该不育系统中, 旨在以花叶作为指示性状来控制不育系的纯度, 从而提高杂交种的纯度, 为油菜杂交种的纯度控制提供一条简捷且有效的途径。

1 材料与方法

1.1 植物材料和分子标记

HYZ1-AB和HYZ1-T分别为在油菜品种沪油杂1号F2中选育的隐性上位互作核不育两型系和临保系; 羽叶87为花叶型油菜[12], 系在浙双758× 花叶86-15杂交后代中选育获得的稳定品系, 其叶片缺刻明显、呈羽状。羽叶87与圆叶型油菜在叶片形态上存在显著差异, 如圆叶型品种浙油50的叶片宽大、顶裂叶呈圆形; 花叶型品系叶87的叶片有2~3对深裂缺刻、顶端呈羽状(图1 )。

本研究采用与Bnms3基因和Bnrf基因紧密连锁的分子标记用于辅助筛选两型系和临保系基因型, 其中与Bnms3基因连锁的分子标记为MS3-89, 与Bnrf基因连锁的分子标记为SC17-25 [15, 16]。

1.2 试验方法

1.2.1 DNA提取、PCR程序、电泳及显色采用简易CTAB法[17]提取基因组DNA, PCR反应按倪西源等[18]的体系进行。扩增产物进行聚丙烯酰胺凝胶(丙烯酰胺∶ 稀酰胺=29∶ 1, m/m)电泳分离, 银染法显色[19], 显色完毕的凝胶用SCANNER 5560型扫描仪(BENQ, 上海)扫描成电子图片后保存, 并统计带型。

1.2.2 花叶两型系和花叶临保系的转育本研究采用F2分离世代选育法和系谱选育法2种途径进行。

F2分离世代选育法实施过程如下:

2009年3月, 以两型系HYZ1-AB中的不育株(基因型为ms3ms3RfRf)为母本, 与花叶品系羽叶87(基因型为Ms3Ms3rfrf)杂交。2009年10月, 播种杂交组合种子(F1)。2010年3月选取单株套袋自交。2010年10月, 选取上述套袋单株种子播种产生F2, 在苗期拔除非花叶单株。2011年1月, 利用分子标记MS3-89和SC17-25筛选出两型系和临保系标记基因型单株。2011年3月, 在花期对两型系、临保系标记基因型单株进行相应的杂交和自交。2011年10月, 播种杂交和自交种子, 此为F3。2012年3月, 花期考察各杂交和自交后代的育性分离, 获得经验证的两型系和临保系。此后, 花叶两型系通过其不育株与可育株杂交进行繁殖, 花叶临保系通过自交进行繁殖。

系谱选育法实施过程如下:

2009年3月至2010年10月间的操作同上述F2分离世代选育法。2011年1月, 利用与分子标记MS3-89和SC17-25筛选出Ms3ms3Rfrf标记基因型的花叶单株。2011年3月, 在花期对Ms3ms3Rfrf标记基因型单株进行套袋自交。2011年10月, 播种自交种子产生F3。2012年1月, 在F3的苗期继续利用与分子标记MS3-89和SC17-25筛选Ms3ms3Rfrf标记基因型单株。2012年3月, 在花期对Ms3ms3Rfrf标记基因型单株进行套袋自交。2012年10月, 播种自交种子产生F4。2013年1月, 在F4的苗期利用分子标记MS3-89和SC17-25筛选出两型系、临保系标记基因型单株。2013年3月, 在花期对两型系、临保系标记基因型单株进行相应的杂交和自交。2013年10月, 播种杂交和自交种子, 此为F5。2014年3月, 花期考察各杂交和自交后代的育性分离, 获得经验证的F5花叶两型系和花叶临保系。此后, 花叶两型系通过其不育株与可育株杂交进行繁殖, 花叶临保系通过自交进行繁殖。

1.3 临保系和两型系的性状考察

以浙油50品种为对照, 在田间对临保系和两型系的生长势、株型和抗病性等进行考察, 筛选优异单株用于繁殖。对初步获得的临保系和两型系, 在成熟期随机选取5株(两型系中选取可育株)测量株高, 并取平均值; 每个小区取5株(两型系中选取可育株)的自交种子用于品质测定, 种子完全干燥后用电子天平(精度为0.01g)测量千粒重, 并利用VECTOR22/N型布鲁克近红外分析仪(BRUKER, 德国)对种子含油量、芥酸及硫苷等品质性状进行测定, 以5株的平均值作为该性状的测定值。

2 结果与分析

2.1 在F2中选育花叶临保系和花叶两型系

在HYZ1-AB_A× 羽叶87 F2中选取96个花叶单株, 利用标记MS3-89和SCA17-25进行基因型筛选。MS3-89和SCA17-25均为共显性标记, 可区分出各基因位点的3种基因型(图2)。经标记筛选获得4株纯合不育株标记基因型(ms3ms3RfRf)、9株两型系可育株标记基因型(Ms3ms3RfRf)和5株临保系标记基因型(ms3ms3rfrf)。

Figure Option

图2 标记MS3-89(A)和SC7-25(B)在Bnms3和Bnrf位点3种基因型中的扩增Fig.2 The amplification of MS3-89 (A) and SC17-25 (B) in three genotypes of Bnms3 and Bnrf respectively

在花期, 选取长势较好的5个花叶Ms3ms3RfRf标记基因型单株和4个花叶临保系标记基因型(ms3ms3rfrf)单株进行套袋自交; 选取2株花叶纯合不育株标记基因型(ms3ms3RfRf)单株与临保系HYZ1-T和5个所选花叶Ms3ms3RfRf标记基因型单株杂交形成12个杂交组合; 4个花叶临保系标记基因型(ms3ms3rfrf)单株与两型系HYZ1-AB的不育株杂交形成4个测交组合。对所用杂交组合及单株自交种子进行种植。

在F3的花期对上年度的杂交及自交后代进行育性调查, 5个花叶Ms3ms3RfRf标记基因型单株自交株系均表现1∶ 3(不育∶ 可育)的育性分离; 花叶Ms3ms3RfRf标记基因型单株与花叶纯合不育株基因型单株的10个杂交组合均表现1∶ 1分离, 这10个杂交组合即为两型系; 4个花叶临保系标记基因型的测交组合均为全不育, 即4株所选单株均为临保系; 然后, 选取长势较好的5个两型系和2个临保系小区分别通过兄妹交和自交进行繁殖。

2013年3月, 经田间考察和筛选, 选取4个两型系和2个临保系继续繁殖。4个两型系的株高分别为139、152、142和154 cm, 千粒重分别为3.38、3.42、3.00和3.79 g, 含油量分别为45.99%、46.27%、46.77%和47.66%。2个临保系的株高分别为151和149 cm, 千粒重分别为4.17和3.96 g, 含油量分别为42.33%和43.96%。浙油50的株高、千粒重和含油量分别为160 cm、4.56 g和51.01%。临保系、两型系及浙油50的芥酸和硫苷含量符合双低油菜标准(芥酸含量< 0.5%, 硫苷含量< 30 μ mol· g-1)[20]。

2.2 系谱法选育花叶临保系和花叶两型系

在HYZ1-AB_A× 羽叶87 F2的96个花叶单株中, 利用标记MS3-89和SCA17-25进行基因型筛选, 获得花叶Ms3ms3Rfrf标记基因型19株, 在花期选取长势较好的10株套袋自交。对收获的自交种子进行品质分析, 选取含油量大于44%, 且低芥酸低硫苷的单株2株进行播种形成F3。

在F3中选取96个花叶单株, 继续利用标记MS3-89和SCA17-25进行基因型筛选, 获得花叶Ms3ms3Rfrf标记基因型25株, 在花期选取长势较好的15株套袋自交, 对收获的自交种子进行品质分析, 选取含油量大于44%的单株4株进行播种形成F4群体。

在F4中选取96个花叶单株继续利用标记进行基因型筛选, 获得纯合不育株标记基因型(ms3ms3RfRf)3株、两型系可育株标记基因型(Ms3ms3RfRf)6株和临保系标记基因型(ms3ms3rfrf)6株。在花期, 选取长势较好的4个花叶两型系可育株基因型单株和4个花叶临保系基因型单株进行套袋自交; 选取2株花叶纯合不育株与临保系HYZ1-T进行测交, 并与4个所选花叶Ms3ms3RfRf标记基因型单株杂交; 4个花叶临保系标记基因型(ms3ms3rfrf)单株与两型系HYZ1-AB的不育株测交。所用杂交组合及单株自交种子进行种植。

在F5的花期, 对上年度的杂交及自交后代进行育性调查。结果表明, 所选4个花叶Ms3ms3RfRf标记基因型单株、4个花叶临保系标记基因型(ms3ms3rfrf)单株和2株花叶纯合不育株标记基因型(ms3ms3RfRf)单株的标记基因型与实际基因型一致。最后, 选取长势较好的4个花叶两型系(花叶纯合不育株标记基因型单株与花叶Ms3ms3RfRf标记基因型单株杂交后代)和3个花叶临保系小区分别通过兄妹交和自交进行繁殖。

2015年3月, 经田间考察后选取3个两型系和2个临保系继续繁殖。3个两型系的株高分别为145、143和138 cm, 千粒重分别为4.46、3.18和3.76 g, 含油量分别为44.06%、44.20%和41.68%。2个临保系的株高分别为152和148 cm, 千粒重分别为3.82和3.74 g, 含油量分别为45.25%和42.16%。对照品种浙油50的株高、千粒重和含油量分别为158cm、5.21g和47.63%。临保系、两型系及浙油50的芥酸和硫苷含量均符合双低油菜标准。

3 讨论

3.1 花叶临保系和花叶两型系的转育方法比较

本研究采用F2分离世代选育法和系谱选育法成功转育了花叶临保系和花叶两型系。此外, 还采用回交选育法转育了花叶临保系和花叶两型系。回交选育法首先以已有花叶纯合不育株(基因型为ms3ms3RfRf)为母本与优异品系(基因型为Ms3Ms3rfrf)杂交, 然后以F1单株为父本与优异品系回交; 在BC1F1中仅保留半花叶单株, 利用与Bnms3和Bnrf基因连锁的分子标记筛选出Ms3ms3Rfrf基因型单株与待转育优良品系继续回交获得BC2F1; 同样利用BC2F1中Ms3ms3Rfrf基因型的半花叶单株与优异品系回交获得BC3F1后自交; 最后在BC3F2中利用与Bnms3和Bnrf基因连锁的分子标记筛选出花叶两型系和花叶临保系基因型单株。

F2分离世代选育法、系谱选育法和回交选育法3种方法各有优缺点, 但均可用于甘蓝型油菜隐性上位互作核不育的两型系和临保系, 也可用于选育具有其它形态标记(如白花)的两型系和临保系。F2分离世代选育法仅在F2进行一次分子标记辅助选择即可获得两型系和临保系, 但获得的两型系和临保系存在一定的遗传差异, 所生产的杂种实际为三交种, 会影响杂种的整齐度。系谱选育法和回交选育法均需要在多个世代进行标记辅助选择, 但获得的两型系和临保系具有较为一致的遗传背景。系谱法适用于对已有不育系(包含两型系和临保系)或品系进行改良, 选育集合不育系和品系优点的新两型系和临保系。回交选育法适用于将已有的优异品系转育成两型系和临保系。

3.2 花叶形态标记用于杂种纯度控制的优点

选育具有形态标记的不育系或恢复系来配制杂种, 可以在亲本繁殖和杂交种生产过程中有效识别并去除杂株, 从而提高杂种的纯度。目前, 育种家已经成功地将花叶[13, 14]、紫茎[21]、茎叶有蜡粉和无蜡粉[22, 23, 24]、幼叶黄化[25]等形态标记应用于油菜杂交种的选育中, 提高了杂交种的纯度。甘蓝型油菜的花叶性状由1对不完全显性基因控制, 且该基因对其它重要的农艺性状无显著的不利影响, 还可以作为指示性状用于构建无选择标记的转基因系统和转基因后代的筛选, 因此花叶性状具有潜在的应用价值[12, 26, 27, 28]。将花叶性状转入到甘蓝型油菜隐性上位互作核不育系统中具有以下优点:在花叶两型系和花叶临保系的繁殖、花叶全不育系的配制以及杂交种生产过程中, 可以在苗期利用花叶作为指示性状, 从而保证花叶两型系、花叶临保系以及花叶全不育系的纯度, 最终提高杂交种的纯度。

杂种纯度鉴定是杂种种子质量检验的重要内容, 通常可用于杂种纯度鉴定的标记, 包括形态标记、生化标记和分子标记。形态标记具有直观易见的特点, 但数量很少; 生化标记数量十分有限, 并且具有组织特异性; 分子标记具有数量多、多态性高及重复性好的特点, 已经应用于水稻[29]、油菜[30, 31, 32]、玉米[33]、大豆[34]等农作物杂种及花卉[35]杂种的纯度鉴定。本研究中花叶形态标记从油菜的真叶期起即可稳定表现、极易识别, 利用花叶不育系与正常叶型恢复系配制杂交种后, 可在杂种幼苗期根据叶型对杂种纯度进行鉴定, 较采用分子标记进行鉴定更简捷、更直观。

4 结论

本研究提出了3种将花叶性状转入到甘蓝型油菜隐性上位互作核不育系统中的方法, 并在转育过程中采用分子标记辅助选择技术筛选两型系和临保系基因型, 获得了具有花叶性状的两型系和临保系, 在花叶不育系繁育及杂交种生产过程中可以根据叶型对纯度加以控制, 最终提高油菜杂交种的纯度。

The authors have declared that no competing interests exist.

参考文献

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