首页分享生物芯片技术在病原微生物检测中的应用

生物芯片技术在病原微生物检测中的应用

来源：花匠小妙招时间：2024-11-24 11:53

除肺神经内分泌肿瘤及11例小细胞肺癌细胞系共105例标本以筛选有意义的基因,结果类癌、大细胞肺癌、腺癌及正常组织很容易被区分,但用表达谱无法区分大细胞性神经内分泌癌和小细胞肺癌。经过三轮非监督分析,将小细胞肺癌分为两组,大细胞神经内分泌癌可合并到这两组中。其中一组预后较好,5年生存率为83%。Bertucci等采用微阵列技术对50例肿瘤的大约8000个基因进行了表达谱分析,总体等级聚类分析在一定程度上能够区分临床上相关的亚群,即能区分正常的和肿瘤的、转移的和非转移的肿瘤,采用监督分析通过识别亚类基因能够区分正常和肿瘤组织、肿瘤相关的,没有淋巴结侵袭和遗传不稳定的及左右结肠之间的差异。用类似的方法可将5年生存率高者和低者区分开。计算机神经网络系统(ANN)可用于完全不同的网络平台(cDNA微阵列和寡核苷酸微阵列),建立一种用于解码人类肿瘤的分类系统。Yu对代表8个组织类型类似的78个肿瘤组织的32000个基因的表达进行了评价,通过cDNA表达谱的ANN进行了正确的分类,准确率达83%。运用这一系统对6个独立单位提供的21种肿瘤的463个组织标本的资料进行了正确的分类。采用寡核苷酸芯片的ANN分析表明,对120例肿瘤的预测准确性为80%;与7个实验室的539例肿瘤的分类结果准确性相似(85%)。总之,随着生物芯片技术的不断发展,将最终实现采用基因表达谱分析预测肿瘤患者的预后和指导化疗。生物芯片技术在病原微生物检测中的应用刘毅(山东省医药生物技术研究中心,山东济南250062)生物芯片技术又称微阵列技术。根据芯片上的探针不同,可分为蛋白质芯片和基因芯片。目前生物芯片技术在病原微生物的诊断及抗药性基因、毒力基因、致病因子的检测等方面已取得了突破性进展,显示出诱人的应用前景。在病原菌检测中的应用1.1检测病原菌细菌培养为细菌鉴定的"金标准,是传统细菌检测技术中最敏感的方法,但培养时间长,还要做生化及免疫试验进行细菌菌种鉴定。生物芯片技术以其传统方法无法比拟的优越性,为病原菌的快速诊断提供了技术条件。细菌中编码rRNA的基因是按5'-16S-23S-5S-3'方式排列的,由两个非编码的间隔区所分开。16SrRNA高度保守,早在1987年就被提倡用于细菌的分类学,目前几乎所有已知细菌的16SrDNA的碱基序列已被测定。16SrDNA由可变区和保守区组成,保守区为所有细菌所共有,可变区在不同种属间有不同程度差异,可变区与保守区交错排列。许多研究者都以16SrDNA为靶基因建立平行检测多种病原菌的微阵列技术,在其保守区设计通用引物进行细菌的基因扩增,针对特异区设计寡核苷酸探针,点在基片上制成寡核苷酸微阵列,再与聚焦激光扫描仪)进行检测分析。由于16SrDNA的高度保守性,探针的特异性设计比较困难,常产生假阳性结果,而23SrRNA的变异性高于16SrRNA,其在细菌鉴别诊断中优于16SrRNA。随着23SrRNA基因测序工作的进展,有些研究者以23SrDNA为靶基因建立检测细菌的微阵列技术,如Anthony等以23SrRNA基因(23SrDNA)为靶基因,设计了一套通用PCR引物并用地高辛标记扩增细菌23SrDNA的可变区,通过化学显色在4h内便可检测和识别出病原菌,对158份细菌培养阳性的肉汤培养基进行检测,准确率为79.7%,在利用寡核苷酸芯片同时检测多种病原菌方面进行了有益的探索,但由于23SrDNA片段较大(3kb),在不同细菌种属中的变异性不同,在部分种属间无法区分菌型,且细菌23SrRNA基因库尚未建立,因而使其应用受到一定限制。16S和23SrDNA的特点,使其难以区分一些同种属的细菌,有研究者尝试以间隔区为靶基因建立微阵列进行同种属的细菌的鉴别,取得了较好的结果。有人也尝试选择rRNA之外的基因鉴定密切相关的细菌,如Kakinuma等选择编码DNA解旋酶B蛋白的gyrB基因作为靶基因,构建的微阵列可鉴别出16SrRNA基因不能区分的大肠埃希菌、志贺菌和沙门菌。生物芯片技术的出现也为难以分离的幽门螺杆菌鉴定提供了有效的技术手段,Salama等构建了H.pylori全基因组基因芯片,这是首次运用基因芯片技术进行H.pylori检测的报道。1.2检测耐药基因传统的耐药性检测方法主要是培养法,至少需要2d时间,实验结果受多种不定因素影响而存在很大误差,而且不能阐明耐药机制。而目前用基因芯片既可以同时检测耐药菌的多个耐药基因,也可以通过检测基因组序列的突变位点及耐药基因来分析其耐药机制。微生物耐药的机制比较复杂,已证明细菌对抗生素耐药性的产生与一些酶的基因发生点突变有关,一种主要的耐药机制是细菌产生的TEM和SHV-家族β-内酰胺酶等,它们通过水解而使抗生素失活,如果发生了突变可产生严重的超广谱β内酰胺酶(ESBLs)或耐酶抑制剂β内酰胺酶(IRT)的表型菌株,引起对超广谱头孢菌素类、单内酰环菌素类及β内酰胺抑制剂的耐药。对喹诺酮类药物的主要耐药机制是靶酶的喹诺酮耐药决定区(QRDR)的染色体上编码DNA解旋酶的gyrA和编码拓扑异构酶parC基因发生突变所致。将针对这些耐药基因的点突变位点设计探针制备的DNA微阵列,以检测耐药菌的多个耐药基因,还可同时对多个耐药菌的多个耐药基因进行检测,指导临床合理有效的使用抗生素。结核病一直是发展中国家较严重的传染病,结核分支杆菌的耐药性也成为较普遍的现象,其耐药分子机制亦逐渐被阐明,结核分支杆菌耐利福平是由于其作用靶分子RNA聚合酶的β亚单位的编码基因(rpoB)突变所致;其吡嗪酰胺酶编码基因(pncA)突变可引起对吡嗪酰胺耐药;耐乙胺丁醇与阿拉伯糖基转移酶的编码基因embABC操纵子突变有关,因此可用基因芯片分析这些耐药基因突变位点,检测耐药的结核分枝杆菌。目前,结核杆菌检测及耐药性突变检测芯片等一系列诊断芯片已开始进入市场。1.3检测细菌毒素和毒力因子葡萄球菌肠毒素(SES)是由金黄色葡萄球菌产生的,可引起急性胃肠炎,目前已知有17种血清型包括SEA到SER(无SEF),其编码基因ent的基因序山东医药2005年第45卷第26

期