转录组学分析揭示了苹果（Malus×domestica）花转变的调节模块对6

转录组分析揭示了苹果（Malus×Dibustaa）的调节模块，响应于6-BA

BMC植物生物学体积19.， 文章编号：93（2019年）引用这篇文章

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指标细节

抽象的

背景

花蕾的生产不足是“富士”苹果园的难以解决的问题。虽然Cytokinin（CK）促进苹果树中的花芽形成，但对调节这种现象的机制知之甚少。

结果

在本研究中，进行了“Nagafu No.2”芽的高通量RNA测序（RNA-SEQ），以表征在花转换的关键期间对6-BA治疗的转录反应。差异表达基因的加权基因共表达网络分析（WGCNA）鉴定了激素信号转导途径，总共84个基因与开花时间基因的表达模式高度相关。发现CK信号组分和胃蛋白酶（GA）信号阻遏物的上调有助于促进花卉过渡。在与未治疗的芽相对比较中，一系列糖代谢和信号相关基因与相对高水平的蔗糖，果糖和6-BA处理芽中的花卉诱导过程中的蔗糖和葡萄糖相关。几种转录因子（即SPLS.，SOC1，FD.， 和col[参与Ga，衰老和光周期调节的开花途径也通过6-BA治疗来上调。此外，还评估了集成CK信号传递CK信令的潜在转录因素，以引发苹果中的花卉诱导;包含光敏色素相互作用因子（PIF1 3），Wuschel相关的Homeobox（WOX3,13)，和CK响应调节器(ARR2）.

结论

本研究介绍了在苹果花卉过渡期间开花和发展相关途径和转录因子对6-BA的响应。它延长了我们对苹果树中CK调节的花卉过渡相关的基本机制的了解。

背景

苹果Malus×Divelsa.Borkh）是全球经济上重要的果树。基于“富士”苹果树的颜色变化，“Nagafu No.2”，占中国种植苹果总面积的超过65％。然而，果园生产“富士”苹果的果园产生了几个有问题的问题，包括可变花卉感应和双年轴承。花蕾的生产不足负责不一致和低的水果产量。

众所周知，外源施用细胞分裂素(CK)可以促进拟南芥和苹果的开花[1，2]。CK是一种关键调节器，其与其他信号（包括GA和糖）结合起来调节植物开发。以前的研究表明，CK / GA比在苹果花诱导中起着核心作用，使得更高的比例更有利于花卉启动[3.]．CK和Ga之间的拮抗关系曾在拍摄商品中报告[4］德拉是一种GA信号抑制剂，可被CK上调，导致GA活性降低[5］．值得注意的是，CK也被发现参与苹果中的糖利用和下沉力的调节[6]．先前的研究报告说，叶子中产生的CK充当刺激细胞划分的触发器Constans1过表达的抑制（SOC1）拍摄顶端商品的表达Sinapis阿尔巴［7]．最近，巴特琳娜等人。［8]报道了细胞分裂素受体功能获得突变体ahk2和ahk3.在拟南芥的漫长的一天条件下，比野生型植物更早地绽放。这些发现清楚地表明了细胞素信令对开花时间的积极作用。然而，有关负责此促销活动的机制，可用的信息很少。

开花是一种复杂的发育过程，具有几个阶段，包括花卉诱导，花香，花卉开发和盛开。苹果中的花卉形成过程持续9至10个月。花卉诱导在前一年的初夏开始，并且在射击增长停止时发生花芽启动[9]．花蕾的命运是在花开始时决定的[10.]．苹果芽不同花器官在明年花的分化和发育发生在当季花盛开12周后[11.]．花卉器官在夏季开始，但在下面的春天之前不会发生过量。

拟南芥中报告了六种不同的开花途径，包括嗜酸盐蛋白（GA），光周期，春化，自主，环境温度和年龄相关途径[12.]．在GA通路中，GA调节DELLA蛋白的水平，而后者反过来又抑制Squamosa启动子结合蛋白质（SPLS.）.SPLS.积极控制花卉促进疯箱基因，如SOC1，在拍摄顶点[13.]．然而，GA被认为是许多木本植物的抑制剂[14.，15.]．然而，这种抑制花卉诱导的机理尚未得到广泛研究。开花的光周期通过涉及的信号级联在叶子中起作用Gigantea.（GI.),概要（有限公司）.CO通过启动转录来激活开花开花轨迹T.（FT.)在长时间内以及随后FT蛋白从叶韧皮部向茎顶端分生组织的移动[16.]．开花基因座C.（方法),fr（星期五）对拟南芥的自然摘要施加春化要求[17.]．自主途径的特征在于，无论白天长度如何，都会延迟开花，并且对vernalization具有高度响应。开花基因座加利福尼亚州（葬礼），开花轨迹D.（盛名），开花基因座kh域（FLK）开花轨迹PA（FPA.）， 和开花轨迹已经（FVE）所有在自主开花途径中发挥重要作用[18.]．除了长时间的感冒（春化途径）外，热敏囊也会影响开花的进展。这营养期短（高级副总裁）用作热敏呼道途径中的重要调解员[19.]．此外，MIR156通过对14的表达水平负面调节年龄相关的开花途径SPLS.（SPL2.，SPL3.，SPL4.，SPL5.，SPL6.，SPL9.，SPL10，SPL11，SPL13，SPL13样， 和SPL15）[20.]虽然MiR156的发育相关的下降部分由糖部分介导[21，22]．

糖在花的诱导中也发挥作用，不仅作为能量，而且作为信号。海藻糖-6-磷酸(Trehalose-6-phosphate, T6P)作为蔗糖可用性的信号，调节植物的开花能力和蔗糖介导的T6P /TREHALOSE-6PHOSPHATE SYHTHASE（TPS.的表达SPL3 / 4/5茎顶分生组织中的基因[23]．关键转录家庭（TF）基因，如wr，bZIPs，mybs.， 和碘缺乏症，也有报道通过多种途径在成花诱导中发挥作用[24，25，26]。

因此，决定CK功能如何在促进Apple中的花卉过渡方面是有意义的。更具体地说，它是否通过调节六种开花途径中的部分或全部或有一个独立的CK开花途径来促进花卉诱导，该途径调节特定的转录因子？在本研究中，RNA-SEQ分析在填充（DAFB）之后的27,30,50和70天，以鉴定通过用6-苄基氨基嘌呤的芽来促进开花的分子事件（6-BA）。它被重新植入了苹果在填充后39到53天的花卉诱导（第1阶段）[27]或开花后3至6个星期[28]，而在77到127 dafb（第2阶段）期间，花差异化发出发出的发起，而发音着发出[27盛开后12周[11.].根据我们以前的研究[29，30.[射击增长的停止总是发生在30张Dafb的紧密景点。因此，这里，27个Dafb的时间点与植物阶段密切合作;30对应于花卉诱导的开始，50和70 Dafb与花卉诱导和花香开始相当，这是花卉过渡的关键期。它被精致为下文中的花卉过渡（30至70 dafb）。转录组分析结果显示了6-BA治疗芽与苹果花卉过渡相关的复杂遗传网络。

结果

6-BA治疗效果芽尺寸和开花强度

两年的观察表明，短枝的开花率明显高于中枝或长枝（图。1一个);结果表明，6-BA处理的植株开花数量高于对照植株(图2)。1a，b）。终端芽的长度，宽度和新鲜重量在6-BA处理的树木中也显着更大，相对于对照树（图。2a、 b）。100 DAFB下芽的扫描电子显微镜显示，6-BA处理不会影响花原基的结构（图。2c, d).数据表明，6-BA处理对芽大小和开花强度有影响。

用300mg /L 6-BA或水处理‘Nagafu 2号’苹果树开花(对照)一个在短芽中开花百分比（SS，<5厘米），中等芽（MS，≥5和≤15cm）和2016年和2017年的长射击（LS，> 15厘米）。b2017年鲜花盛开时拍摄的照片。CON =用水处理的对照树;6-BA =经6-BA处理的树木。条形图表示平均值±标准误差(n= 3)。*表示有显着差异p< 0.05

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长肥2号苹果树短枝(< 5厘米)顶芽的形态特征一个对照中芽生长的进展和6-BA治疗芽在花卉过渡期间（30-70 dafb）。b芽新的重量，长度和宽度控制和6-BA处理树木的花卉过渡期。c和d对照树顶芽在100 DAFB下的扫描电子显微照片(c）和6-BA处理的树木（d）.条形图表示平均值±标准误差(n= 3)。*表示在一个时间点处理和未处理芽之间的显著差异p< 0.05

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6-BA处理芽和对照芽的RNA序列分析

从每个样本中获得的原始读取总数在4471万到6926万之间。过滤后，每个库的干净读取数量在4350万到6560万之间。大多数样本中超过86%的清晰读取可以被唯一地映射到苹果基因组(附加文件1:表S1)。每个样本中大约有28000个平均FPKM≥1的基因被认为是表达的(图)。3.a). Pearson相关分析表明，生物重复之间的基因表达水平高度相关，具有R2 > 0.92 (Additional file2:图S1)。6-BA处理的芽和对照芽在每个时间点的比较中鉴定出了DEGs(图。3.B;附加文件3.：表S2）。通过B30与C30，B50与C50和B70对C70的成对比较获得了总共8015个非冗余度。在B30 VS C30比较中，上调3803，1989年被调节。在B50对比较中，上调1215，下调2035;在B70对比较中，上调1070，下调1070个，下调946（图。3.b, c)。

6-BA处理和对照花芽在花过渡期间的RNA-seq统计(30、50和70 DAFB)。一个每百万碱基对测序的转录本序列中每千碱基平均片段数(FPKM)的每个样本中表达的基因数。酒吧图(b）和venn（c)，表明6-BA处理与对照芽在30、50和70 DAFB时的DEGs数量

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选择表示6-BA响应基因的12次进行RT-QPCR分析。结果表明，RNA-SEQ和RT-QPCR数据类似并产生类似的表达模式，从而证实由RNA-SEQ确定的表达水平（附加文件4：图S2）。

苹果花芽中6-BA响应基因的功能分类

从B30 VS C30，B50 VS C50和B70 VS C70比较中获得的次数进行了Kegg途径浓缩分析（附加文件5：表S3）。B30与C30次数最具显着富集的Kegg是植物激素信号转导，伴随果糖和甘露糖代谢，半乳糖代谢，代谢途径，二次代谢物生物合成，以及淀粉和蔗糖代谢。在从B50与C50比较中获得的DEG中鉴定出五kegg途径是显着的，包括植物激素信号转导，光合作用，光合作用 - 天线蛋白，DNA复制和植物病原体相互作用。最后，确定三个Kegg途径在B70与C70比较中显着富集，包括内质网，类胡萝卜素生物合成和植物激素信号转导的蛋白质处理。

花转化过程中6-BA响应基因的聚类分析

进行了层次聚类(h -聚类)分析，以提供更深入地了解8015个非冗余DEGs的时间历程概况。因此，在6- ba处理组和对照组中，所有的deg被分为6个亚群(图6- ba处理组和对照组)。4A，B;附加文件6：表S4）。具有相似表达模式的基因最可能以类似的方式调节[31].因此SOC1同源物（图。4c），这是众所周知的关键开花途径集成商[32[进一步检查。二SOC1同系物被分类在对照组的第6亚群中（图。4一种）。Kegg Encroce表示光合作用（28.4％），光合作用 - 天线蛋白（38.6％），植物激素信号转导（10.1％），黄酮类生物合成（17.3％）和光合生物中的碳固定（13.2％）被过度代表对照组的子簇6（图。4d）。在6-BA治疗组中，两个SOC1转录物表现出由子簇3表示的表达模式（图。4B，D）。该亚聚簇中的前五个富集途径包括激素信号转导（8.8％），淀粉和蔗糖代谢（8.6％），不匹配修复（11.1％），半乳糖代谢（11.0％）和精氨酸和脯氨酸代谢（9.1％）（无花果。4d）。它是众所律的基因，这些基因被分类为与相同的子群SOC1可能在花的过渡中起重要作用。

6-BA处理和对照苹果花蕾转变过程中DEGs的聚类分析和亚群功能分类控制中每个集群的表达模式(一个）和6-BA治疗的芽（b）， 分别。两者的表达模式SOC1对照芽花转变过程中的转录本(c）和6-BA治疗的芽（d）.在图C和D的右侧列出了在6-BA处理芽中的对照芽和子簇3中的五种富集的功能途径。每个簇的平均值显示为蓝色或红线，单个基因的表达模式显示为灰线

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加权基因共表达网络识别与花卉过渡相关的生物过程和候选基因

通过带有8015个非冗余DEGs的加权基因共表达网络分析(WGCNA)鉴定了8个模块(图)。5a).模块-性状关系分析显示，2个开花基因(SOC1和SPL5.）和两个信令组件（ARR2和TPS1.），与“绿松石”模块高度相关。“绿松石”模块基因在激素信号转导通路基因中显着富集（图。5C)包含总共84个基因。此外，光合作用、果糖和甘露糖的代谢和代谢途径也被过度描述。在开花相关基因中，只有SOC1在“绿松石”模块中包含了很多边(附加文件7:表S5)。84个基因中的80的表达模式高度相连SOC1（重量 ≥ 0.1）（图。5d）。糖代谢和信号通路中的主要基因，如INV1，INVB，INVE，SPS2, SPS4，IDD4，IDD5，IDD7，IDD12，IDD14，TPS1.， 和TPS5也与SOC1(附加文件7:表S5)。然而，“蓝色”模块与SPL9.但与盖；虽然“黑色”模块与强烈呈负相关SPL9.但正相关盖(无花果。5b).“蓝色”模块显著富集糖相关代谢途径;植物激素信号转导途径(图。5C）。“蓝色”模块中富含糖相关的代谢途径和激素信号转导途径中44个基因的细胞照片表示有边缘SPL9.（重量 ≥ 0.1）（图。5e)。

在6-BA处理的差异表达基因（DEGS）的加权基因共表达网络分析（WGCNA）在花卉过渡期间在三个采样时间点（30,50和70个DAFB）上进行的6-BA处理和控制芽。一个说明共同表达基因的九个模块的分层簇树。8015°中的每一个由树中的叶片和主要树枝的每个九个模块表示。下面面板显示了分配颜色的模块，例如“绿松石”，“红色”，“黑色”等。注意“灰色”模块代表未分配的基因。b模-性状关系表现模特征基因与性状相关性的重要性。左边的面板提供了9个模块的颜色键。右边的颜色刻度显示模块-特征的关联范围从−1(绿色)到1(红色)。c“绿松石”和“蓝色”模块基因的KEGG通路显著富集。“纠正p-Values标记在每个酒吧的顶部。dcytoscape表示关系SOC1在“绿松石”模块中富集富集富集激素信号转导途径（边缘重量≥0.10）的共同表达基因。ecytoscape表示关系SPL9.在“蓝色”模块中共同表达富含激素信号转导和糖代谢途径(边缘重量≥0.10)的基因。小写后缀的基因名用于区分相同基因名的不同基因id。相应的基因ID在附加文件中:表S7

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在花卉骚动期间激素和糖相关基因

基于其功能分类和WGCNA分析，其表达受6-BA处理影响的基因主要与激素信号转导途径和糖代谢途径有关。特别是在图2中提出了CK和GA信号传导组分的表达的变化的细节。6和附加文件8:表S6。三个编码DELLA蛋白同源物的转录本(盖），一种作为GA受体注释的一个基因（gid1c.)和两种ga调控的转录因子(PIF3）相对于未处理的对照芽，在30和70dafb的6-Ba处理芽中表现出更高水平的表达;但是在50 dafb的表达下降（图。6a).相反，一种GA调节转录因子，gamyb.（GAM1.),GID1.成绩单(GID1B.)表现出对6-BA处理的相反反应，相对于上述GA信号成分的反应(附加文件3.：表S2）。推定的CK信号传导组分，细胞蛋白受体（ahk4.和ahk2），三个Phosphotransmitters（AHP1）和四个响应调节器（ARR2，ARR9， 和ARR6）在30和70dafb的6-Ba处理的芽中显着上调，但在50 bafb下下调（图。6c），相对于未经治疗的对照。两个芸苔类固醇信号转导组件（BSK和BZR1.)和三个细胞周期调节剂(两个CYCD3-1和一个CYCD3-2）也存在于“绿松石”模块中，并表现出类似的表达模式模式作为细胞素信令组件（附加文件8：表S6）。

6-BA处理和控制芽中CK和胃植物蛋白代谢和信号通路相关的关键基因的表达。一个“Nagafu 2号”苹果6-BA处理芽中赤霉素代谢和信号转导途径成分以及GA相关DEGs的相应热图表达谱。b6-BA处理苹果花过渡时期芽中ZR和GAs含量的变化c“Nagafu 2号”苹果6-BA处理芽中CK代谢和信号转导途径成分及相应的CK相关DEGs热图表达谱

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如图所示。6B，在30 dafb的6-Ba处理和对照芽之间的CK水平没有显着差异，但在50 dafb的对照芽中，在6-BA处理的芽中显着更大。不是noly ck生物合成基因（IPT1.）还有CK降解基因（ckx1.和CKX7.)在30和70 DAFB时表现出较高的表达水平，而在50 DAFB时则表现出较低的转录水平(图2)。6C）。与对照芽相比，在30和50Afb的6-BA处理芽中，气体水平较低。然而，同时，GA降解基因的表达水平更高（Ga2ox2.）在30和50个Dafb和Ga Biosynthesis基因的表达水平（GA20OX2，花王，ko.，ks.， 和CPS.)。6b，附加文件9：表S7）。

还测量了不同糖的水平（图。7b）。6-BA处理样品中的蔗糖水平高于30和70dafb的对照。6-BA处理芽中的葡萄糖水平高于30和50dafb的对照芽，而果糖的浓度明显高于30dafb。淀粉含量在6-BA处理的芽中显着降低，而不是在30 dafb的对照芽中，但在所有其他采样时间点的两个基团的芽中相似。与果糖和葡萄糖合成相关的基因，包括INV1，INV4，SPS2，SPS4，Glyco.， 和FKB，6-BA处理的芽在30和/或50 DAFB处理时显著上调(图。7一种）。SSY2.然而，基因在30和70dafb的6-Ba处理的芽中下调（图。7一种）。在6-BA处理的芽中观察到这些基因可能部分地负责较高水平的果糖和葡萄糖，以及淀粉的较低水平。两个推定TPS.成绩单(TPS1.和TPS5），在6-BA处理的芽中表现出更高水平的表达，而不是30 dafb的对照芽。另外三个TPP.成绩单(TPPA, TPP4和TPPD.)将T6P转化为海藻糖和Pi[33[ba]在30 dafb的6-BA处理中明显上调，但在50AFB下下调（图。7一种）。这些表达式的表达模式表明，在花转换期间，T6P代谢和蔗糖可用性在6-BA处理的芽中更活跃。

一个6-BA处理‘长肥2号’苹果芽糖代谢途径组成及糖相关基因热图表达谱b长肥2号苹果花期转化过程中蔗糖、果糖、葡萄糖和淀粉6-BA处理和控制芽体的变化c在“Nagafu No.2”苹果6-BA治疗芽中的热映射表达曲线。条表示标准错误（n= 3)。*在0.05级表示显着差异

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参与六种不同开花途径的开花基因的同源物在转录组数据中鉴定出来。所有这些都被发现在'绿松石'模块中（图。7c），除了COL3，SPL9.，SPL12， 和AGL9．所有的SPLS.基因（SBP2，SPL5,6，8，14.， 和15.）除了30 dafb的6-Ba处理的芽中，除了SPL9.和SPL12，这是下调的。col，FD,和GI.基因在6-BA处理的芽与对照芽中也表现出不同水平的表达。表达FT.然而，6-BA基因作为光周期调控开花途径的整合子，在6-BA和对照芽之间的表达没有差异(附加文件9：表S7）.在温度感应、自主和春化调节开花途径中起重要中介作用的基因，如高级副总裁，葬礼， 和VRN，也在转录组中检测到。然而，只观察到微小的变化，响应于6-BA治疗和治疗和控制芽之间的差异没有达到意义的程度（附加档案9：表S7）。一些开花途径整合基因，如SOC1和AP1.；在30和70 DAFB时，6-BA处理的芽中表达显著上调。

对6-BA处理响应的转录因子

573个非冗余转录因子的表达由6-BA处理在花转变的时间过程中诱导（图。8a).将鉴定的转录因子分为56个不同的转录因子家族(附加文件)10.:表S8)。据报道，SBP、bZIP、CO-like和MADS-box家族的转录因子家族成员控制开花时间(Yu et al.， 2012, Shim et al.， 2017)。在30 DAFB时，6-BA处理过的芽中，大多数转录因子的>表达量是对照芽的2倍(图)。8C）。有趣的是，也发现BHLH，NAC，HB和GATA转录因子家族的成员在30 dafb的6-BA处理的芽中急剧上调（图。8b）。共有4,6,3和2个成员，分别在30 dafb，相对于对照芽，在处理的芽中分别表现出> 8倍的高度转录水平，相对于对照芽，在30 dafb（图．8c).这些转录因子可能在引导苹果茎尖分生组织向花发育方面发挥重要作用。

一个6-BA处理在3个采样时间点(30、50和70 DAFB)上调或下调苹果花过渡期转录因子的数量。b根据不同折叠变化水平分类的转录因子家庭成员的数量。c在30 DAFB下对6-BA处理最有反应的转录因子的热图表达谱

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讨论

应用6-BA促进苹果芽花芽形成的研究报道[2]已在本两年的研究中得到证实(图。1）.然而，与此促进相关的机制尚未得到广泛调查。在苹果中，花卉诱导在停止射击生长后开始[9]．我们之前的研究确定，“Nagafu 2号”的平均茎长在28-30 DAFB之后几乎没有增长[29，30.]．基于这一发现，“长肥2号”树木被喷洒了300毫克L-12次(27次和30次DAFB)，代表花诱导期的开始。利用RNA-seq对6-BA处理过的苹果花蕾的转录组进行了表征。综合分析响应基因，只提取对6-BA响应的开花途径和整合细胞分裂素信号的潜在候选基因诱导苹果成花，下面将进行详细讨论。

RNA-Seq分析鉴定了苹果花芽中对6-BA响应的基因

对比分析6-BA处理过的芽和对照的表达数据，发现在30、50和70 DAFB位点上，共有5793个、3802个和3252个基因被差异表达。3.）.然而，在B30对C30比较中观察到大量的次数，表明许多基因迅速响应于6-BA治疗[34]．一组常见的DEG表现出与开花时间整合子相同的转录调控(SOC1），Cytokinin响应调节剂（ARR2)和蔗糖可用性信号(TPS1.）在WGCNA分析的“绿松石”模块中鉴定出来（图。5）.激素信号转导途径表现出最富含富集的类别。在该途径中，通过30DAFB的6-BA处理明显上调细胞蛋白信号传导组分。就像甜樱桃与氢氰胺的研究一样[35[它鉴定了细胞蛋白途径是花芽突破中最上调的途径之一。已知A型ARR迅速响应CK信令[36]．三种A-型Arr基因的上调（两个ARR9s和一个ARR6)， 6-BA处理的芽在30 DAFB(图。6c)表明6-BA处理立即诱导了CK信号。在拟南芥中，CK通过上调GA信号抑制基因的表达来降低GA活性RGA.和盖［5].根据这一假定模式，盖在30和70 DAFB时，6-BA处理的芽中表达量高于对照。此外，一种ga调控的转录因子(GAM1.）在同一时间点表现出较低的表达水平（图。6一个额外的文件8：表S6）。类似地，在GA之后的葡萄花的转录组测序3.治疗找到了Ga.3.-诱导的无籽可能是由于CK水平的降低通过大幅度上调5CKX.GA后的基因3.应用程序(37]．因此，细胞蛋白和赤霉素对抗一些发育过程。先前的研究还发现，较高的CK / GA比率有利于苹果花序[3.]．在本研究中，6- ba处理过的花芽在花的过渡过程中发现了较高水平的ZR和较低水平的GA。6b） ，进一步证明6-BA处理支持苹果的花起始。

“绿松石”和“蓝色”模块也在一系列与糖代谢途径相关的基因中富集(图。5c).其中两个基因被注释为蔗糖合酶(SPS4和Sus2.)基因和三个转录本编码转化酶(一个INV1和两个INV4）;所有这些，在30 dafb的6-Ba处理芽中表现出四倍的更高表达水平，而不是在对照芽中（图。7一种）。漂浮逆变酶和蔗糖合成酶被认为是响应CK的关键部件，以建立水槽器官内的沉降力[38，39]．增加的细胞壁转化酶活性导致拟南芥的速度加速[40]．作为一个库器官，苹果的顶芽需要从植物的其他部分获得糖来触发成花诱导。在本研究中，高水平的糖可能是由于6- ba处理的芽中糖代谢相关基因的高表达，如转化酶。三个挪威基因（INV1，INVB， 和INVE）展示了一个边缘SOC1（重量> 0.1）（附加文件8、表S6)。因此，一种可能的情况是，CK信号作为特定转化酶亚型的正中介，增强了苹果芽发育过程中的库强度，促进了芽的生长和花的诱导。6- ba处理后的芽体积增大可能不仅受细胞周期基因的诱导控制，而且还受库强度组分增加的支持。在这方面，CK曾有报道通过调节库强度组分来调节某些器官/组织的同化物分配和库强度[6，38]．除了作为一种能量来源，糖还可以作为诱导开花的信号。T6P是蔗糖利用率的指标，TPS控制蔗糖的表达SPL通过mir156直接和间接拍摄顶端公司中的基因[23].与以前的报告一致[5的显著上调TPS1.和TPS56-BA处理的花蕾对蔗糖的利用效率可能更高。此外，转录水平的7SPLS.（三SPL5.， 一SPL6.， 一SPL8.， 一SPL14和一个人SPL15）表现出与之相同的反应TPS.到6-BA治疗（图。5b），建议TPS-SPL.模块可能在苹果开花中发挥重要作用。但是，我们不能排除CK促进的可能性TPS.介导开花途径。综上所述，我们的研究结果表明，6-BA处理不仅控制库强度，而且还影响糖信号;这最终促进了苹果开花。

6-BA影响GA-，老化和光周期相关开花途径中的介体基因

在我们的转录组数据中发现了许多与六种不同先前描述的开花途径相关的基因的同源物（附加文件9:表S7)。有趣的是，七份注释为期限,作为年龄相关开花途径的指示基因，在30 DAFB位点6-BA处理显著上调(图2)。7c)较早的报告[22表明与年龄相关的开花途径部分是由糖和光合作用介导的。巧合的是，许多糖代谢和光合作用相关的基因在WCGNA的“绿松石”模块中显著富集(图。5）.这些数据表明，6-BA治疗通过影响糖代谢和光合作用来影响与年龄相关开花途径中的集成剂的表达。戴尔斯已经通过直接互动部分确认部分地防止开花SPL9.和SPL15；这是通过激活促进开花的基因SOC1［13.]．三个转录物被注释为盖被6-BA处理显著上调，而SPL9.基因在30 dafb下显着下调，（图。6A和7C）。其他SPLS.和SOC1然而，基因在同一时间点没有下调(图。7C）。这些结果表明，额外的因素可能会激活其他因素SPLS.为了对抗戴尔斯在SPL9.表达式在苹果。gamyb.还据报道是另一种作用在GAI / RGA / RGL的另一个关键基因，但在上游LFY.，以促进开花。我们的结果决定了时间盖转录物在6-BA处理的芽中上调，gamyb.是表达下调(无花果。5a).的下调LFY，而在6- ba处理的芽中未观察到9:表S7)。据报道GA20OX和氧化镓通过调节在GA相关开花途径中发挥作用SOC1，在拍摄商品中[41]．在目前的研究中，GA20OX被显着下调和氧化镓在50dafb的6-BA处理芽中显着上调（图。6a） .如果SOC1Ga-Metabolism基因的基因也诱导苹果花卉诱导，SOC16- ba处理的芽在同一时间点转录水平显著升高。然而，这种关系并没有被观察到。在我们的研究中，不一致的关系可能gamyb./LFY.和Ga20ox / Ga2ox.-SOC1表达可能是由于功能专业化，导致苹果苹果与烟草中的GA相关开花途径的功能变化，如拟南芥所观察到的花卉阻遏物。col，GI.和FT.是与光周期相关开花途径的三个关键介质[35]．col和GI.通过6-BA处理显着上调表达水平（图。5一个),FT.不是。跨附带因子CO组织专门调节水平FT.产生的转录物和Ft蛋白从叶形韧皮蛋白移动到芽顶部分类，其中它用FD起作用以激活下游开花基因，例如AP1.［16.]．FD.和AP1.在本研究中，6-BA治疗显著上调了这两种蛋白的表达。因此，在苹果中，细胞分裂素可能通过基因转录激活影响光周期开花途径FD.但不是FT.．类似的结果在拟南芥中也有报道[1]．已知其他开花途径的转录水平，包括vernalization，热敏和自主，仅在本研究中表现出次要或没有变化（附加文件9:表S7)。与自主相关开花途径相关的整合基因尤其如此。这一结果与之前的研究结果一致，即这些基因是结构性的，并且它们在促进开花方面的作用独立于环境刺激发生[42]．

整合细胞分裂素信号的潜在候选基因诱导苹果花的诱导

细胞分裂素受体功能获得突变体的研究，ahk2和AHK3,指示细胞分裂素信号在长日照条件下也起着重要的促进开花时间的作用[8]．在本研究中，在苹果花转换期间的6-BA治疗中，显着上调了细胞肝素相关基因。在Mad-Box和SBP转录因子家庭成员中若干花卉集成商表达的相应响应，如SOC1和Spl5 6 8 14 15(图。7C）。因此，我们不能排除细胞分裂素响应调节剂介导细胞肝素信号传导以通过激活苹果中的SBP或MAD-BOX开花基因的转录来促进花卉诱导的前提。其他几种转录因子基因，包括BHLH66.，PIF1，高等商学院，汉，WOX1.，WOX3.，NAC94.， 和NAC90.；分别属于BHLH，GATA，HB和NAC转录因子家族，也表现出对6-BA处理（>八倍上调）的强烈反应（图。8c） 。PIF是一种bHLH转录因子，已知在昼夜节律中起作用[43并且与植物的转变密切相关[44]．因此，通过6-BA治疗可以激活BHLH转录因子可能影响光周期介导的开花。据报道，HEC是另一种BHLH转录因子，以在Gynoecium Developmence期间协调生长素和细胞蛋白之间的串扰[45]．因此，我们有兴趣推测bHLH转录因子在调控苹果花器官发育过程中可能通过调节细胞分裂素和生长素信号之间的交互作用而发挥作用。有报道称，HB转录因子家族基因中的wuschele相关同源盒在干细胞稳态调节中起核心作用[46]，并直接作用于细胞分裂素信号的下游[47]．与本报告一致，在6-BA处理的芽中，三种WOX转录物显着上调（图。7c,额外的文件10.:表S8)。其中两个的高水平表达，WOX3.和WOX13，对应于的高表达水平SOC1（重量> 0.1）（附加文件10.：表S8）。因此，Wuschel相关的Homeoboxes家族Mumbers可能有介导细胞蛋白信号的功能，以促进苹果花卉诱导。Bernier（2013）推测类似的假设[7]表达的Sasoc1.在茎顶分生组织中Sinapis阿尔巴与Cytokinin和Cytokinin之间的局部相互作用有关沃斯．功能的功能汉在里面盖塔基因家族和n在里面n基因家族与发育过程的关系已经得到了很好的研究;包括茎尖分生组织的形成、分生组织活动的维持和花的发育[46，48].作为边界监管机构，汉拟南芥花发育过程中转录因子桥接分生组织和花器官原基边界[48]．因此，由于这些转录因子被6-BA治疗显着上调，因此它们可能是潜在的候选者，其功能可以加速拍摄Appical Metistem的形成和对照苹果中的花式器官发展。

结论

本研究获得的数据为6-BA促进苹果开花的分子机制提供了新的见解。9）.结果表明与糖代谢和激素信号相关的基因受到6-BA治疗的显着影响。在6-BA治疗后上调细胞分裂素信号转导的关键基因，包括Ahk.，AHP.， 和arrs。

苹果花蕾对6-BA的响应模型。6-BA处理后，红色字体基因表达上调，绿色字体基因表达下调。灰色字体的基因表明，6-BA处理后，它们的表达水平发生了变化，但不显著。以红色背景显示的细胞分裂素(CK)和糖表明它们的水平在6-BA处理后升高。绿色背景中的赤霉素(Gibberellins, GAs)和淀粉表明6-BA处理导致它们的水平下降。→意味着晋升;意味着抑制

全尺寸图像

虽然GA降解基因的更高表达水平（Ga2ox2.)导致GAs水平降低，表达水平升高盖在6-BA处理过的芽中。细胞分裂素与赤霉素的拮抗作用可能有利于苹果的成花诱导。蔗糖合成和T6P代谢相关基因大部分在6-BA处理的芽中表达量较高，如SUS，SPS，TPS.和TPP。它表明，6-BA治疗通过调节水槽强度和糖信号来促进苹果花卉诱导。另外，通过6-BA处理显着影响Ga，年龄和光周期开花途径中的基因。还提取了一些潜在的候选转录因素，其涉及到苹果中触发苹果花卉诱导的细胞素信号传播。Mad-Box，SBP，WUSchel相关的家庭框架和BHLH系列的若干成员，如SOC1，SPL5.，SPL6.，SPL8.，SPL14，SPL15，WOX1.， 和PIF.可能有介导细胞蛋白信号的功能，以促进苹果花卉诱导。进一步的研究需要重点突变或过表达关键基因以确定其提出的功能。并揭示机械地连接到苹果花卉诱导的候选路径和事件。

方法

植物材料及处理

该研究是在中国陕西省杨凌现代农业技术园区的苹果示范苗圃（108°04'E，34°16'N）。三十六岁的'nagafu no.2'/'m26'/M. Robusta.在完全绽放中随机选择没有表现出替代轴承的REHD树，并分成六个五棵树块。完整绽放定义为终端芽上的80％的王花的日期。将三个指定的块在27 dafb的晴朗的早晨喷洒在晴朗的早晨，并以30毫克为300毫克L的6-BA−1．将其他三个嵌段用水喷洒并用作对照。该实验是在连续几年（2015和2016）中进行的，以确定在次年短芽（<5cm），中间芽（≥5和≤15cm）和长枝（> 15厘米）的开花百分比（2016年和2017年）。第二年治疗组用于进行以下实验。

在27 DAFB第一次施用6-BA之前，采集短枝上的顶芽作为第一次取样(C27)。在30 DAFB第二次施用6-BA 2 h后，再次采集6-BA处理组和对照组的顶芽。随后，每20天取样一次顶芽，直到70 DAFB。所有的抽样作业都在上午10:00至11:00进行。样本采集分别为C27、C30、C50、C70、B30、B50、B70;C、B分别为对照组和6-BA处理组。收集的芽保存在−80°C，直到下次使用。

RNA-SEQ的RNA提取

选取C27、C30、C50、C70、B30、B50、B70的芽进行RNA-seq分析。从5棵苹果树上收集60个芽作为一个生物重复，每个时间点采集3个生物重复。总RNA提取采用基于十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)的方法[29]．在1%琼脂糖凝胶上验证RNA的完整性，使用纳米光度计®分光光度计(IMPLEN, CA, USA)评估RNA的纯度。使用Qubit RNA Assay Kit (Life Technologies, CA, USA)测量Qubit 2.0®荧光仪中的RNA浓度，使用RNA Nano 6000 Assay Kit (Agilent Technologies, CA, USA)在Bioanalyzer 2100 Bioanalyzer 2100系统(Agilent Technologies, CA, USA)中评估RNA完整性。RNA-seq分析只使用通过质量检测的RNA样本。

RNA-Seq文库构建和测序

由诺沃金研究所(Novogene, Tianjin, China)进行文库构建和测序。这些文库在Illumina Hiseq 4000 (San Diego, CA, USA)平台上测序，生成150 bp的配对端reads。原始序列读取首先使用内部Perl脚本进行处理。在此步骤中，通过以下步骤获得干净的读取:1)删除带有适配器的序列;2)去除未知碱基占序列总数10%以上的序列;3)去除低质量reads(在单个序列中低质量碱基的百分比超过50%)。计算干净数据的Q20、Q30、GC含量和序列重复水平。所有的下游分析都利用了高质量、干净的数据。

映射读取参考基因组和基因表达水平的定量

Apple参考基因组被组装从'Golden Delious'双倍单倍体线上。以前的研究[41[报告从重新排序的“Nagafu No.2”的Re-Sheding读取80.22％的清洁读数成功地映射到“金色美味”的参考基因组上。与参考基因组相比，“Nagafu No. 2”的身份为98.62％。因此，上述清洁读数被映射到最新的“金色美味”苹果基因组序列[49]使用TopHat软件及默认参数[50]．使用HTSEQ计数软件获得映射到每个基因的读取的数量[51]．每千万个碱基对测序的转录本序列的每千碱基片段[52]，以确定每个基因的相对表达水平。基于FPKM值，使用R函数cor(一个R包)计算生物重复之间的Pearson相关性。

差异表达基因(DEGs)的鉴定和功能富集

使用DESEQ R包的调整后的读数来确定DEGS [51].获得P使用Benjamini和Hochberg算法来纠正 - 用于控制虚假发现率的值。如果调整后，DEG的表达水平被宣布为重要的P值(padj）<0.01和a | log 2（折叠变化）| > 1 was observed.

使用R软件包进行数据校正后，使用KOBAS软件确定京都基因和基因组百科全书(KEGG，http://www.genome.jp/kegg/）使用调整后的P-value≤0.05为显著富集途径。利用R.的H-cluster命令对非冗余DEGs的转录组变化进行聚类分析。

识别共表达网络模块

用于加权基因共表达网络分析（WGCNA）的R包装构建基因共表达模块[53]．采用动态树切割算法，变异截断系数为0.25，β幂为10，最小模块大小为50个基因，过滤样本间变异小的基因，减少层次聚类。3个控制开花时间关键基因FPKMs的显著模态-性状关系(SPL9.MD12G1059800,SOC1MD02G1197400，和SPL5.md11g1251800）和三种细胞素素组分（ARR2MD16G1017900)、赤霉素(盖MD02G1039600）和蔗糖（TPS1.MD03G1250300）通过计算模块实际值来识别信号传导。关系高关系的模块（r2> 0.7）与ARR1，TPS.，SOC1， 和SPL15使用Cytoscape 3.1表示，With With WGCNA边缘重量> 0.10 [54]．

逆转录定量PCR（RT-qPCR）

RT-qPCR分析是在与RNA-seq相同的发育阶段使用单独收集的芽样本进行的。用于特定基因RT-qPCR分析的引物是使用Primer 6.0软件设计的，由Sangon Biotech合成（附加文件11.：表S9）。在我们之前的工作中详细描述了使用的RT-QPCR协议[29]．除了使用沙［55]及WL40［56作为家务基因。HISTONEH3和肌动蛋白，在转录组数据中表达水平没有变化，作为数据标准化的内参基因。2-ΔΔct方法用于计算每种检查基因的相对表达。

糖，淀粉和激素测量

〇糖和淀粉共使用0.8g冷冻芽来提取可溶性糖和淀粉。用于测量糖和淀粉的方法如Rosa等人所述。（2009）[57]．

激素分析 -使用总共0.5g的冷冻芽，用于确定每个样品中扎丁核苷（Zr），植物蛋白，气体和ABA的浓度。使用粘液 - 等人所述的酶联免疫吸附测定测定样品萃取和激素浓度。（2001）[58]．

扫描电子显微镜

来自3次从控制和6-BA处理的树木的100 dafb收集来自短芽的20个末端芽。如Foster等人所述，制备解剖芽以扫描电子显微镜。（2003）[27]．

统计分析

芽尺寸和体重，糖含量和激素水平数据进行单向分析方差，学生的T检验用作DPS软件的平均分离试验，版本7.0（浙江大学，杭州，中国）。对于RT-QPCR数据和RNA-SEQ数据之间的相关分析，计算Pearson相关系数（R），并使用DPS软件进行双尾测试。

缩写

6-苄基氨基嘌呤

细胞分裂素

概要

十六烷基二甲基溴化物

盛开后的日子

差异表达基因

开花基因座加利福尼亚州

开花基因座C.

开花轨迹D.

开花基因座kh域

开花轨迹PA

每千碱基的转录本片段，每百万碱基对测序

fr

开花轨迹T.

开花轨迹已经

赤霉素

Gigantea.

基因本体论

分层集群

Kyoto基因和基因组的百科全书

光敏色素相互作用因子

RNA序列

逆转录定量PCR

Constans1过表达的抑制

Squamosa启动子结合蛋白质

营养期短

海藻糖-6-磷酸盐

转录的家庭

TREHALOSE-6PHOSPHATE SYHTHASE

加权基因共表达网络分析

WUSCHEL相关同源盒

玉米素核苷

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下载参考

致谢

不适用。

资金

这项工作主要是中国自然科学基金基金（31672101; 31801813）和中国博士后科学基金会（2018 M631207）。陕西省陕西省科技创新工程项目（2015Ny114,2016ktzdny01-10）支持植物处理和样品收集。通过中国苹果研究系统（CARS-27）的支持来确定糖，淀粉和激素的含量。RNA-SEQ和所有数据分析由中国自然科学基金基金（31672101; 31801813）。随着中国博士后科学基金会的支持（2018 M631207），对逆转录定量PCR和扫描电子显微镜进行。

可用性数据和材料

所有相关的补充数据在本手稿中作为附加文件提供1，2，3.，4，5，6，7，8，9，10.和11.．本研究中使用的所有清洁和处理的转录组序列数据已提交到登录号SRR6510620下的NCBI短读取归档。

作者信息

从属关系

西北农业与林业大学园艺学院系，杨凌，712100

李友梅，张东，安娜，樊胜，左希亚，张鑫，张立志，高才，韩明玉，邢立波

作者笔记

作者

贡献

Myh和LBX正在响应设计工作和修改稿件，YML进行了所有实验并写了稿件。DZ有助于数据分析和稿件修改。RA涉及修改稿件，SF参与RNA提取，表达和数据分析。XYA和XZ进行了表型。LZZ和CG参与了生理指标的测量。所有作者都已阅读并批准了稿件。

通讯作者

对应于libo兴．

道德声明

作者的信息

作者均就职于西北农林大学园艺学院，陕西杨凌712,100

伦理批准和同意参与

该品种长肥2号和盐肥6号在中国广泛栽培。本研究中使用的两个品种均来自陕西省杨凌现代农业科技园苹果示范苗圃。植物材料的收集符合机构，国家和国际准则。根据当地法律进行了实地研究。本研究不包含任何需要伦理同意或批准的研究。

同意出版物

不适用。

利益争夺

两位作者宣称他们没有相互竞争的利益。

出版商的注意事项

施普林格《自然》杂志对已出版的地图和机构附属机构的管辖权要求保持中立。

附加文件

附加文件1：

表S1。6-BAT处理组和对照组在27、30、50和70 DAFB下取样的苹果芽RNA测序统计摘要。（PDF 346 kb）

附加文件2：

图S1Pearson在样本复制之间的相关性。C表示控制，B表示6-BA治疗。0,1,2,3呈现采样时间点的顺序。（PDF 292 KB）

附加文件3：

表S2与B30和C30, B50和C50, B70和C70比较得到的deg。(XLSX 1270 kb)

附加文件4：

图S2比较RNA-seq和qRT-PCR测定的代表性基因的表达谱。柱代表qRT-PCR测定的表达（左y轴）。（A）使用肌动蛋白管家基因。（b）使用相对表达式计算组蛋白管家基因。数值代表3个生物重复的平均值±SE。直线表示RNA-seq在第一个样本时间点(右y轴)相对于FPKM值的表达。圆形代表6-BA治疗组，三角形代表对照组。计算qRT-PCR和RNA-seq表达的相关性及其相关性P值表示。(PDF 272 kb)

附加文件5：

表S3。富含差异表达基因的Kegg途径在30,50和70个Dafb的6-BA治疗和控制之间。（XLSX 110 KB）

附加文件6：

表S4。对照和6-BA处理差异表达基因的h聚类，如图。4．(XLSX 1156 kb)

附加文件7：

表S5。cytoscapeinputSOC1和SPL9.基因与其他基因在“蓝绿色”和“蓝色”模块中。(XLSX 371 kb)

附加文件8：

表S6。6-BA处理对‘长肥2号’苹果芽激素和糖相关差异表达基因的响应(XLSX 18 kb)

附加文件9：

表S7。开花基因参与热感觉、自主和春化途径。（XLSX 18 kb）

附加文件10：

表S8。转录因子对6-BA处理有反应。(XLSX 165 kb)

附加文件11：

表S9。本研究中用于QRT-PCR测定的引物。（PDF 155 KB）

权利和权限

开放获取本文根据创意公约署署署的条款分发了4.0国际许可证（http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/）如果您向原始作者和源给出适当的信用，则允许在任何介质中进行不受限制的使用，分发和再现，提供指向Creative Commons许可证的链接，并指示是否进行了更改。Creative Commons公共领域奉献豁免（http://creativecommons.org/publicdomain/zero/1.0/）除非另有说明，否则适用于本文中提供的数据。

再版和权限

关于这篇文章

引用这篇文章

李，Y.，张，D.，A，N ..等等。转录组分析揭示了苹果(Malus ×家蝇)花器官向6-BA转变的调控模块。BMC植物杂志19，93（2019）。https://doi.org/10.1186/s12870-019-1695-0

下载引用

已收到：2018年3月16日

接受：2019年2月25日

发表：2019年3月06日

迪伊：https://doi.org/10.1186/s12870-019-1695-0

关键词