植物如何防止“病从口入”

01植物免疫回顾

进入正文前，让我们简要回顾一下前面给大家介绍过的植物免疫的内容。植物虽然没有特定的免疫细胞，但植物体中每一个细胞上都有识别病原体的受体，可使植物作出合适的免疫反应。位于植物细胞表面的模式识别受体（Pattern recognition receptors，PRRs）能够识别病原体的相关分子模式（Pathogen-associated molecular patterns PAMPs），并激活模式触发免疫（Pattern-triggered immunity，PTI）来阻碍病原体的入侵和定殖。病原体通过分泌效应蛋白（Effector）来逃避或抑制PTI，这导致了效应触发易感性（Effector-triggered susceptibility，ETS）。反过来，植物进化出细胞内核苷酸结合和富亮氨酸重复序列受体（Nucleotide-binding leucine-rich repeat receptors，NLRs），能够感知效应蛋白，并激活效应因子触发免疫（Effector-triggered immunity，ETI）。病原体又可能通过进化使效应因子更多样化等方法，来逃避或抑制ETI(Jones and Dang, 2006)。研究表明，植物在长期进化中形成的PTI和ETI，两者并非泾渭分明的防线，而是强强联手以诱导对病原体的全面免疫(Ngou et al., 2022)。想要了解具体内容可以查看植物免疫系统的“御敌”机制。

图1 植物免疫系统的“之字形”模型(Jones and Dang, 2006)。

在这场分子战争中，植物表皮是病原体需要突破的第一道屏障，它就像我们人体表面的皮肤，对各种微生物具有物理阻挡作用。植物表皮的屏障例如植物表皮上的微小绒毛能够阻碍病原体附着，角质层和蜡质层可以抵抗病原体的直接侵入等。然而叶、茎及其他植物器官上皮上许多小的开孔，会成为许多病原体入侵植物的“突破口”。

02气孔

气孔就是位于植物表皮的开孔之一，由成对的半月形保卫细胞以及若干副卫细胞组成（图2），它是植物与外界环境进行气体交换的重要通道，也是植物丧失水分的主要通道。

图2 气孔结构示意图（图片来源：http://Dreamstime.com）。

2.1 气孔开闭原理

植物叶片气孔开闭与保卫细胞的构造有关。内侧（靠近孔的一侧）细胞壁较厚，外侧（与其他细胞相接触的部位）的细胞壁较薄（图2）。同时，保卫细胞要比叶肉细胞和表皮细胞的体积要小得多，只要有很少量的离子和水分进出，就会引起保卫细胞内膨压较大程度的改变，引起细胞扩展或者收缩，以调节气孔开闭和孔径变化。

成熟的保卫细胞间没有胞间连丝，但是其细胞壁上有从孔侧向外辐射状排列的硬质微纤丝和微管。当保卫细胞吸水膨压增大时，外侧细胞壁比内侧细胞壁伸展程度大，而内侧相对较厚的细胞壁伸展程度较小。在此情况下，由于放射状排列的微纤丝和微管的牵引，保卫细胞孔侧细胞壁向着外侧的方向弯曲，从而使保卫细胞之间的孔隙变宽，气孔开放。在保卫细胞失水膨压减小时，外侧细胞壁收缩较快，气孔关闭。气孔的开闭能够调控和促进光合作用和水分利用效率的动态平衡，最终达到植物个体适应环境的目的。气孔开闭是一个十分复杂的过程。一般情况下，植物会尽可能多地减少水分的散失和保证CO2的供给，因此气孔昼开夜闭。

2.2 气孔免疫

大量病原体可以利用气孔进入植物内部，如野油菜黄单胞菌（Xanthomonas campestris pv armoraciae）、葡萄生单轴霉（Plasmopara viticola）和柄锈菌属（Puccinia）等，它们只能通过气孔进入植物中。长期以来，气孔一直被认为是病原菌入侵的被动开口和主要通路。然而，近年来研究发现气孔在面临病原菌入侵时并非一直处于被动地位，而是能主动抵御病原菌入侵，表明气孔保卫细胞可以感知病原菌并触发植物的免疫信号级联，在白天关闭气孔，打破气孔运动的自然昼夜节律。病原体触发的气孔关闭是一种快速反应（＜1h）。这种由植物通过长期进化出的机制，能够感知病原体进而关闭气孔，被称为气孔防御/免疫(Melotto et al., 2017)。

03文献分享

在这里给大家分享一篇发表在Nature期刊上的文章“The calcium-permeable channel OSCA1.3 regulates plant stomatal immunity”，我们一起来了解一下Ca2+渗透通道OSCA1.3调节植物气孔免疫的机制。

研究背景：

在模式植物拟南芥（Arabidopsis thaliana）中，细胞表面的一种PRR FLS2能够与细菌鞭毛蛋白结合，识别鞭毛上的flg22区域。这使FLS2与细胞表面共受体激酶BAK1形成一个活性受体复合物。该复合物会磷酸化细胞质激酶BIK1，BIK1的磷酸化会激活下游免疫反应，如BIK1接着磷酸化NADPH氧化酶RBOHD，以激活细胞内活性氧的产生。BIK1是气孔免疫所必需的，如果保卫细胞缺失编码这种激酶的基因，植物就不能对flg22作出反应。

不同的环境刺激会诱导胞浆Ca2+浓度（[Ca2+]cyt）的快速上升，以激活信号传导反应。例如，植物对PAMPs或非生物胁迫（如高渗透压、干旱等）的感知会引起[Ca2+]cyt快速短暂地上升。尽管[Ca2+]cyt在气孔关闭中起着核心作用，但由于Ca2+信号的瞬态性质导致植物响应多种刺激的Ca2+渗透通道难以研究(Thor et al., 2020)。

发现问题：

BIK1如何引起Ca2+内流而导致气孔关闭的机制一直不清楚，相应的Ca2+通道仍然未知。

提出假设：

研究者提出假设，他们认为BIK1可能直接磷酸化一个或多个参与气孔免疫的未知Ca2+通道，然后导致Ca2+内流而引起气孔关闭。在前期研究中，已知拟南芥OSCA1.3（At1g11960）是保守的Ca2+通道OSCA/TMEM63家族中的成员，但其功能并没有验证，已有研究显示它在PAMP处理后会迅速磷酸化。而且，在OSCA1.3预测结构的位于细胞质的第一个loop环（loop1）中，含有与RBOHD一致的保守motif（Ser-X-X-Leu），这与BIK1使RBOHD磷酸化的位点相似。综上，研究人员推测OSCA1.3是被BIK1磷酸化的Ca2+渗透通道，而且loop 1中具有两个可能被BIK1磷酸化的丝氨酸位点（图3a）。

图3 （a）OSCA1.3的预测蛋白拓扑结构和可能的BIK1磷酸化位点。蓝色数字表示跨膜区域。可能的BIK1磷酸化位点用红色突出显示；（b）OSCA蛋白家族进化第一分支OSCA1.1到OSCA1.8的蛋白质序列比对，显示氨基酸30到95。可能的BIK1磷酸化motif（SxxL/I）以红色突出显示。蓝色深浅表示比对一致度%。

实验结果：

1.OSCA1.3定位于质膜

通过亚细胞定位实验，OSCA1.3融合绿色荧光蛋白（GFP）定位于质膜（图4），符合OSCA1.3作为Ca2+通道这个假设。

图4 在OSCA1.3启动子的控制下表达OSCA1.3-GFP的osca1.3拟南芥突变体叶片的共聚焦显微图片。左图：无处理；右图：用2M NaCl使细胞质壁分离来突出质膜定位结果。绿色：绿色荧光蛋白；品红色：叶绿体（chlorophyll）自发荧光。

2.OSCA1.3与BIK1互作

接着，验证OSCA1.3是否是与BIK1互作的下游蛋白。烟草瞬时表达的BIK1-HA与OSCA1.3-GFP能够免疫共沉淀，但不与质膜标记物GFP-LTI6b免疫共沉淀（图5a）。用PAMP flg22处理10min并没有影响OSCA1.3-GFP和BIK1-HA之间相互作用（图5a）。在稳定转化的拟南芥体系中也证实了BIK1-HA和OSCA1.3-GFP的相互作用，但flg22处理10min降低了这种相互作用（图4b），这与之前对BIK1-RBOHD互作的观察结果一致。

图5 验证OSCA1.3与BIK1互作的Co-IP实验。（a）本氏烟叶中瞬时表达的BIK1-HA和OSCA1.3-GFP在无处理和1μM flg22处理10min的免疫共沉淀实验，GFP-LTI6b为阴性对照；（b）稳定表达的拟南芥体系中BIK1-HA和OSCA1.3-GFP或GFP-LTI6b的免疫共沉淀。用GFP琼脂糖beads进行免疫沉淀。用GFP和HA抗体进行Western blot。CBB，考马斯亮蓝。

3.OSCA1.3被BIK1磷酸化，其中S54是主要的磷酸化位点。

然后研究人员试图确定BIK1是否磷酸化OSCA1.3。OSCA1.3可能的磷酸化位点于细胞质loop1。Pull down实验表明，OSCA1.3-loop1直接与GST-BIK1相互作用，并可被其磷酸化（图6a，b）。这种磷酸化依赖于BIK1的激酶活性，因为激酶失活的突变体GST-BIK1（KD）不能磷酸化MBP-OSCA1.3-loop1（图6b）。对OSCA1.3-loop1中可能的磷酸化位点（S49和S54）和相邻的S50进行靶向突变，然后进行Pull-down实验并利用放射自显影技术，结果显示BIK1主要的磷酸化位点是S54（图6b）。值得注意的是，在体内进行选择性反应监测试验（SRM）证实了flag22诱导的OSCA1.3磷酸化是由BIK1介导的（图6c），进一步证明OSCA1.3是免疫信号传导过程中BIK1的底物。

图6 （a）GST-BIK1和MBP-OSCA1.3-loop1（氨基酸30-95）进行Pull-down实验。以MBP为对照。用谷胱甘肽树脂进行GST pull-down实验，用GST和MBP抗体进行Western blot检测；（b）对OSCA1.3-loop1中可能的磷酸化位点进行靶向突变，然后进行Pull-down实验并利用放射自显影技术；（c）在flg22处理后0和5min，胰蛋白酶磷酸化肽SSPLHS[+80]GALVSK的SRM相对定量。

4.OSCA1.3是BIK1激活的Ca2+渗透通道拟南芥中有15种OSCA亚型，分布在4个不同的进化支系。其中，OSCA1.1和OSCA1.2被验证在植物中具有功能特征，并参与对渗透胁迫的响应。拟南芥和水稻（Oryza sativa）中的其他OSCA亚型已被证明是机械敏感的非选择性阳离子通道，在某些情况下，被认为是Ca2+渗透通道。为测试OSCA1.3是否是Ca2+渗透通道，研究人员首先利用Ca2+摄取缺陷酵母突变体cch1/mid1来进行实验，结果显示，野生型酵母（WT）与表达OSCA1.3的cch1/mid1突变体（cch1mid1::OSCA1.3）生长情况类似（图7a），这表明表达OSCA1.3促进了该异源Ca2+摄取缺陷系统中的Ca2+运输。然后，用COS-7细胞进行的膜片钳实验（注：膜片钳技术用以记录通过离子通道的离子电流来反映细胞膜单一的或多个的离子通道分子活动）显示，OSCA1.3表达时存在电流，而且与BIK1共表达时电流增加，无激酶活性的BIK1（KD）和OSCA1.3 S54突变没有增加电流的效果（图7b，c）。这些结果表明OSCA1.3是BIK1激活的Ca2+渗透通道，同时也再次证明S54是主要的磷酸化位点。

图7 （a）OSCA1.3能够弥补酵母突变体cch1/mid1的Ca2+摄取缺陷。DsRed作为对照。48h后拍摄照片；（b）在表达OSCA1.3或OSCA1.3（S54A）以及BIK1或BIK1（KD）的COS-7细胞中，用膜片钳记录离子电流。电压脉冲的施加范围为–100至+60mV；（c）b中实验检测的电流-电压（I/V）曲线图。

5.OSCA1.3和OSCA1.7参与气孔免疫

在拟南芥OSCA蛋白家族第一分支中，只有OSCA1.7（At4g02900）在相同位置上具有与OSCA1.3相似的Ser-X-X-Leu motif。同样在COS-7细胞中OSCA1.7介导的电流能够被BIK1提高（图8a）。值得注意的是，OSCA1.3和OSCA1.7单独对Ca2+具有渗透性，并且在两个通道共表达时，这种渗透活性和图7c相比没有提高（图8b）。

图8 （a）pCI-OSCA1.7与pCI-BIK1或与pCI-BIK1（KD）共转染的COS-7细胞中记录的全细胞形态电流的典型迹线（左图）和相应的统计分析（右图）。OSCA1.7是BIK1激活Ca2+通道；（b）BIK1能够激活共表达OSCA1.3和OSCA1.7的细胞中的电流。用pCI-OSCA1.3、pCI-OSCA2.7与pCI-BIK1或与pCI-BIK1（KD）共转染的细胞中记录的典型电流（左图）和相应的I/V曲线（右图）。值得注意的是，电流强度不高于表达OSCA1.3+BIK1（图7b，c）的细胞中记录的电流强度。a和b中使用的全细胞膜片钳方案与图7b，c中使用的方案相同。

研究人员获得了双纯合插入突变体osca1.3/osca1.7（以下简称osca1.3/1.7）。同时，为了将检测Ca2+的分辨率达到细胞级别，得到了野生型（Col-0）或osca1.3/1.7的Ca2+生物传感器YC3.6。保卫细胞中Ca2+峰值的单细胞测量显示，与Col-0相比，osca1.3/1.7中flg22诱导的Ca2+上升程度降低（图9a）。同时研究者发现[Ca2+]cyt的增加受到抑制与osca1.3/1.7被flg22诱导实现气孔关闭的功能受损有关（图9b）。

完整叶片的气孔孔径测量结果显示，在使用损伤相关分子模式（Damage-associated molecular patterns，DAMPs）AtPep1处理时，osca1.3/1.7中的气孔关闭也受到抑制。（注：AtPep1也被称为植物激活子效应肽，AtPeps由受损细胞受到胁迫后直接分泌，介导细胞间信号传递。AtPep1可以通过激活SLAC1和它的同源蛋白SLAH3，介导不依赖于ABA的气孔关闭。）当植物感觉到缺水时，脱落酸（ABA）可以调节气孔关闭。这种激素还可以控制气孔防御，因为ABA缺乏的植物的气孔在感知到病原菌时不能有效地关闭。但在osca1.3/1.7中，ABA处理下的气孔关闭不受影响（图9c），这也与完整叶片蒸腾作用的数据一致（图9d）。这些结果表明，OSCA1.3和OSCA1.7的突变不影响ABA介导的气孔关闭，OSCA1.3与OSCA1.7在免疫过程中的气孔关闭中具有特定作用。

用低毒力的丁香假单胞杆菌（Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000 COR）侵染Col-0、osca1.3/1.7与bak1-5植株，osca1.3/1.7对菌株的敏感性与bak1-5相当（图9e）。最后，为了测试OSCA1.3和OSCA1.7的作用是否由BIK1磷酸化介导，研究人员用OSCA1.3或OSCA1.3 S54A的表达试图去回补osca1.3/1.7的气孔关闭缺陷。OSCA1.3的表达能够恢复flg22诱导的气孔关闭，而OSCA1.3 S54A的表达则不能（图9f）。综上，数据表明OSCA1.3是气孔免疫所需的Ca2+渗透通道，其激活和功能取决于BIK1介导的磷酸化。

图9 OSCA1.3和OSCA1.7参与气孔免疫。（a）方框图和散点图显示了Col-0 YC3.6和osca1.3/1.7 YC3.6保卫细胞中flg22诱导前5min的钙尖峰的的波形重建曲线的总曲线下面积（AUC）。每个点代表单个细胞的总AUC。标记形状表示单个独立的实验重复，方框图表示Col-0或osca1.3/1.7所有点的分布；（b）用5μM flg22或水处理下，野生型、osca1.3、osca1.7和osca1.3/1.7植物的气孔孔径；（c）用水、5μM AtPep1或10μM ABA处理下，野生型和osca1.3/1.7植物的气孔孔径；（d）野生型和osca1.3/1.7植物的完整叶片中记录到的叶片蒸腾作用。在叶柄处使用10μM flg22和10μM ABA处理，以0.01%乙醇作为对照；（e）测定在Col-0、osca1.3/1.7和bak1-5植株中接种丁香假单胞杆菌3天后细菌的数量；（f）用5μM flg22或水处理，野生型、osca1.3/1.7和用pOSCA1.3（WT）或pOSCA1.3（S54A）回补osca1.3/1.7植株的气孔孔径。

6.结论

该研究确定了免疫信号传导中BIK1磷酸化的Ca2+渗透通道。其他OSCA家族蛋白已被证明是非选择性阳离子通道，因此不能完全排除OSCA1.3或OSCA1.7可能会运输其他阳离子，其他阳离子也可能有助于气孔关闭。值得注意的是，OSCA1.3和OSCA1.7以及BIK1对它们的调节似乎都不是ABA诱导的气孔关闭所必需的。这些结果进一步证实了PAMP和ABA是通过独立的机制调控而导致气孔关闭的。该研究揭示了通过BIK1磷酸化激活Ca2+通道的关键机制。

图10 flg22诱导的Ca2+内流导致气孔关闭的模式图(Yoshioka and Moeder, 2020)。

细菌鞭毛的flg22由FLS2识别，FLS2与BAK1蛋白形成复合物，并将磷酸基团（P）添加到蛋白BIK1中，从而激活它。然后BIK1磷酸化Ca2+通道。在上述分享的文献中OSCA家族的两种蛋白质OSCA1.3和OSCA1.7在该反应过程中可作为Ca2+通道发挥作用（这两种蛋白质中的一种或两种是否共同发挥这一作用尚不清楚）。Ca2+通过通道流入，但后续导致气孔关闭的机制尚不清楚。虽然通道蛋白OSCA1.3/1.7使Ca2+内流能够使气孔关闭，并不依赖于ABA，但由ABA介导的气孔关闭或感染病原体所诱导的气孔关闭可能涉及相同的下游调控机制，都通过水从保卫细胞中移出来关闭气孔。那么，一种可能是通过钙依赖性蛋白激酶（CDPKs）激活S型阴离子通道（SLAC）。SLAC使阴离子（带负电的离子）离开细胞，从而造成水分流失，导致气孔关闭。

小远叨叨

研究气孔免疫的文献不少，这次主要就分享这篇经典的文章啦，下次有机会再对气孔免疫已有的研究进行归纳喔。

References：

Jones JD, Dangl JL. 2006. The plant immune system. Nature 444:323-329.

Melotto M, Zhang L, Oblessuc PR, et al. 2017. Stomatal Defense a Decade Later. Plant Physiol 174:561-571.

Ngou BPM, Ding P, Jones JDG. 2022. Thirty years of resistance: Zig-zag through the plant immune system. Plant Cell 34:1447-1478.

Thor K, Jiang S, Michard E, et al. 2020. The calcium-permeable channel OSCA1.3 regulates plant stomatal immunity. Nature 585:569-573.

Keiko Y, Wolfgang M. 2020. Calcium channel helps shut the door on intruders. Nature 585:507-508

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