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《食品科学》：南京农业大学肖红梅教授等：无花果采后炭疽病原菌鉴定及贝莱斯芽孢杆菌防治效果

来源：花匠小妙招时间：2024-10-30 10:09

无花果（Ficus carica L.）风味独特、肉质鲜美，但皮薄多汁，采后呼吸代谢旺盛，其果目结构又极易遭受病原微生物的侵染，因此会造成严重的采后病害。炭疽病是无花果采后主要病害之一，炭疽菌侵染寄主类型的范围甚为广泛，不同的寄主中均具有1 种或多种优势炭疽菌株，明确无花果炭疽病原体的种属对无花果炭疽病的防控具有重要的意义。

生防菌的应用可以有效规避或减轻化学药剂所带来的问题，绿色安全健康的生物防治成为国内外的研究热点。病原菌的分离、鉴定是分析无花果病害流行规律的前提。南京农业大学食品科学技术学院的杨婉艺，姜毅，肖红梅*等从具有典型炭疽病发病症状的无花果病果上获得一株炭疽病菌FC.006（以下简称FC.006），前期研究发现，生防菌B.velezensis RD.006（以下简称RD.006）对FC.006菌丝生长具有显著抑制作用；果实异孔接种实验证明RD.006可以诱导提高果实对FC.006的抵御能力；RD.006处理能够降低采后‘布兰瑞克’无花果的病情指数，有效保持果实品质。在此基础上，本实验采用多基因序列联合鉴定FC.006的基因序列，同时进一步探究RD.006对其的防治效果，以期为无花果采后病害的鉴定和生物防治提供理论基础，为我国农林产业“两减一增”战略实施和相关技术提供理论支撑。

1 无花果采后病原菌株FC.006的分离与鉴定

1.1 病原菌FC.006形态鉴定结果

从无花果病果上分离得到一株病原菌株（图1A）。依据科赫法则，将其接种至无花果上进行回接验证致病性并再次分离，得到再分离菌株FC.006（图1B），显微镜下观察其菌丝细长，表面较平滑，存在部分分支（图1C）。FC.006在PDA培养基上形成的菌落边缘规则，颜色由中央黑褐色向外扩至四周颜色变淡至边缘带呈白色，在培养后期菌落背面处可以观察到黑色附着胞形成的轮纹状特征，易产生橙色分生孢子堆，分生孢子呈柱形，两端钝圆（图1D）。

1.2 病原菌FC.006的多基因序列分析鉴定

无花果病原菌株FC.006经rDNA-ITS序列初步鉴定为胶孢刺盘孢复合种（Colletotrichum gloeosporioides），对ITS-GAPDH-TUB-CHS-ACT-CAL 6 个基因联合序列与表3所示的模式菌株序列进行同源性比较，并构建系统发育树（图2），FC.006鉴定为胶孢刺盘孢下的小种哈锐炭疽菌（C.Horii）。

1.3 FC.006的致病孢子浓度筛选结果

哈锐炭疽菌FC.006的孢子能够有效引起无花果炭疽病的发生。无花果果实炭疽病害发病初期伤口周围发黑，后期黑色病斑逐渐扩大，呈轮纹状且向内凹陷，并伴有白色菌丝和橙色孢子产生，果实软烂且果目渗有腐烂汁水。由图3可知，在设置的接种范围（1×10 3 ～1×10 7 个/mL）内，随着孢子接种浓度的增高，果实的病斑直径增加，果实炭疽病发病情况严重程度加大。接种孢子浓度1×10 5 个/mL和1×10 6 个/mL果实的病斑直径接近，在接种3 d和5 d时，病斑直径分别约为1.5 cm和2.4 cm；接种5 d时，接种孢子浓度1×10 7 个/mL的果实完全腐烂。感染低孢子浓度（1×10 3 个/mL）的果实显现较为轻微的病状，果实组织对病原菌侵染具有一定的抵御能力；接种高孢子浓度（1×10 6 个/mL和1×10 7 个/mL）的果实发病严重，果实组织快速进入死亡状态；孢子中间浓度（1×10 4 个/mL和1×10 5 个/mL）侵染引起果实较为严重的炭疽病，果实发病进程适中，因而接种1×10 5 个/mL孢子浓度果实的生理状态可用于本实验后续研究。

2 贝莱斯芽孢杆菌RD.006对炭疽菌FC.006的抑制作用

在RD.006和FC.006对峙平板上发现，RD.006对FC.006具有明显的抑制作用，加入RD.006后，FC.006的生长直径明显变小，菌落呈现规则的梭形；在RD.006的生物胁迫下，FC.006已显示出逆境下的特殊生理形态，菌落中央提前生成了橙色的孢子（图4B）。培养至8 d时，对照组FC.006菌落已生长至整个平板（图4A），此时RD.006的抑菌率达到85%（图5），对峙平板中FC.006菌落停止扩展且与RD.006之间存在着明显的抑菌带。

3 贝莱斯芽孢杆菌RD.006对无花果炭疽病的防治效果

如图6所示，在贮藏5 d时，RD-FC组的果实病斑直径显著小于FC组和FC-RD组果实（P＜0.05）；贮藏7 d时，RD-FC组果实的病斑直径是同时期FC组果实的41.5%，而FC-RD组果实的病斑直径达2.3 cm，与此时只接种病原菌的FC组果实病斑直径接近，说明预防接种贝莱斯芽孢杆菌RD.006对无花果采后炭疽病有良好的防控作用，且提前接种生防菌的接种方式有助于降低感染炭疽病果实腐烂的严重程度，这可能是因为提前接种生防菌会诱导果实组织产生更强的抗病性。

4 贝莱斯芽孢杆菌RD.006对无花果果实抗性基因的影响

苯丙氨酸解氨酶（PAL）、肉桂酸-4-羟化酶（C4H）和4-香豆酰-辅酶A连接酶（4CL）是苯丙烷代谢途径中的3 个关键酶。取样时间0 h对应果实损伤接种RD.006菌悬液（RD-FC组）和无菌水（FC组）之后的24 h。由图7A～C可知，RD-FC组中FcPAL、FcC4H、Fc4CL表达量分别在取样0 h呈现较高的表达量，可能是因为生防菌属于生物源激发子，可以诱导果实的抗性基因表达上升，取样0 h之后这3 个基因的表达量都出现不同程度的下降，之后在不同时间点又恢复上升趋势并在54 h左右达到峰值。FcPAL在FC组的最高表达量显著小于其在RD-FC组的最大表达量（P＜0.05），同时后期表达量峰值出现的时间滞后于RD-FC组，FcC4H和Fc4CL基因的表达结果与FcPAL相类似，说明生防菌RD.006处理可以诱导果实迅速发生抗病反应，并且在贮藏后期维持抗病相关基因FcPAL、FcC4H、Fc4CL更高的表达水平。

木质素等化合物的合成与植物抗病性密切相关，过氧化物酶（POD）参与木质素合成反应的最后一部分，即木质素单体氧化聚合反应，此反应需要H2O2的参与。抗坏血酸酶（APX）和过氧化氢酶（CAT）可以协同清除细胞产生的H2O2，进而减少过氧化物对细胞的破坏。由图7D～E可知，取样0 h两组的FcAPX表达量无显著差异；在12 h时RD-FC组果实的FcAPX表达量迅速上调至最高值，而FC组的变化并不显著；在取样后期（36～72 h），RD-FC组FcAPX表达量显著小于FC组（P＜0.05）。FcCAT的表达结果与FcAPX表达模式相类似。这可能是因为RD.006的接种诱导了活性氧的爆发，促使植物细胞APX和CAT活性上升以清除产生的过氧化物。而FC组果实FcAPX、FcCAT在取样后期（36～72 h）的表达水平较高，促进APX和CAT的合成以清除H2O2等有害物质，这可能是因为FC.006侵染也会使果实细胞遭到破坏并产生大量H2O2、自由基等有害物质，激活了果实的抗病性，但这种抗病反应具有一定的滞后性。

由图7F可知，RD-FC组果实的FcPOD表达水平在取样0 h时显著提高，在取样前期（0～24 h）始终维持较高的表达水平，同时期果实组织的苯丙烷代谢途径中关键酶FcPAL、FcC4H、Fc4CL同样有较高的表达水平，因此推测RD.006的接种可以迅速激活果实的苯丙烷途径，增强寄主的抗病性，促使果实类黄酮、木质素等相关抗性代谢物的生成。

炭疽菌（Colletotrichum sp.）是世界上侵染植物的十大致病性真菌之一，炭疽病的病程较短，若不加以防控，一旦感染无花果，在短时间内果实便会发生不可控制的软烂。无花果炭疽病病原菌的鉴定是生物防治炭疽病的基础。目前，炭疽菌的分类主要依赖于形态学特征结合基因ITS进行鉴定，但炭疽菌的纯培养特征会因培养条件的不同而存在差异，而单一的ITS序列可能会存在一定的错误率，因此采用多基因序列对近亲缘关系的炭疽菌的研究更加可靠。引起无花果炭疽病的病原菌种类与果实品种、地理位置、栽培等条件有关。

对植物病原菌具有良好拮抗效力的芽孢杆菌中，多数菌株可以通过分泌具有抑菌活性的代谢物质来达到抑菌的目的。有研究表明，贝莱斯芽孢杆菌可以分泌抗菌蛋白、聚酮类化合物、脂肽类抗生素等抑菌物质。本实验中的离体平板对峙实验表明，贝莱斯芽孢杆菌RD.006能通过产生扩散性抑菌物质有效抑制哈锐炭疽菌FC.006菌丝的生长。

Priming机制是指植物组织被生物或非生物激发子处理后，植物显示出更强的防御能力，被认为是植物中不同类型诱导抗性的共同机理。生防菌对寄主果实抗性的诱导主要是通过激活一系列生化防御反应及果实的免疫系统，同时能够促进伤口处结构性壁垒物质的积累，病原菌侵染时会发挥更强的组织抗病性。苯丙烷代谢途径是与植物抗病性密切相关的次级代谢途径，本实验结果显示，生防菌RD.006的预防接种会诱导无花果苯丙烷代谢途径关键酶相关基因的表达上调，表明RD.006会一定程度上激活苯丙烷代谢途径。该途径会产生酚类物质、类黄酮和木质素等物质，其中酚类物质和类黄酮对病原菌有直接的杀死作用，而木质素能提高细胞壁组织木质化的程度，从而提高对病原菌的抵御能力。本实验中同样发现，相较单独接种病原菌的果实，生防菌和病原菌都接种的果实FcPAL、FcC4H、Fc4CL、FcAPX、FcCAT、FcPOD基因在接种后有较高的表达水平，而只接种病原菌的果实6 个抗性基因的相对表达量在不同时间点也有较高的表达量，但最高值普遍小于生防菌和病原菌同时接种的处理组。佐长赓等的研究同样表明，贝莱斯芽孢杆菌B.velezensis BG-2与病原菌协同参与诱导厚皮甜瓜CAT、POD、SOD等防御酶的激活。此外，从本实验结果中可以发现，在贮藏期间的部分时间点，只接种病原菌的FC处理组果实的6 个抗性基因表达量高于生防菌和病原菌都接种的RD-FC组果实，可能是FC.006的强致病作用对生防菌RD.006诱导果实组织的免疫响应具有一定的抑制作用。有研究同样表明，生防菌直立顶孢霉（Acremonium strictum）产生的枯草菌素类似蛋白AsES可以作为生物激发子诱导植物的防御反应，促进活性氧的积累，加强木质素、胼胝质等加强细胞壁支撑物质的生物合成，上调FaPR1、FaCHI23、FaPDF1.2、FaCAT、FaCDPK、FaCML39等抗性基因的表达，而病原菌隐秘刺盘孢（Colletotrichum acutatum M11）能够产生一种扩散化合物抑制AsES诱导的植物抗性响应。

结论

从无花果病果上分离出一株病原菌FC.006，通过形态学鉴定结果结合基于ITS、GAPDH、TUB、CHS、ACT、CAL多基因联合系统发育树分析鉴定为Colletotrichum horri，其能够引起无花果炭疽病的发生。在离体条件下贝莱斯芽孢杆菌RD.006可以直接抑制FC.006菌丝的生长，在培养8 d时的体外抑菌率达到85%，预防接种RD.006能够激活无花果果实的苯丙烷途径，诱导抗氧化相关基因表达迅速上升，RD.006可以作为一种生物激发子诱导果实抗性，有效防治无花果采后炭疽病害。后续研究可聚焦于RD.006抑菌活性代谢物质的鉴定，此外，苯丙烷代谢途径分子调控机制等还需深入研究。本研究结果可丰富无花果采后病原菌的种类，同时为采后病害的绿色防控提供理论基础。

本文《无花果采后炭疽病原菌鉴定及贝莱斯芽孢杆菌防治效果》来源于《食品科学》2023年44卷第 15 期 204 - 211 页，作者：杨婉艺，姜毅，汤静，席飞，孙佩馨，肖红梅。 DOI: 10.7506/spkx1002-6630-20220718-205. 。点击下方阅读原文即可查看文章相关信息。

实习编辑；云南师范大学生命科学学院母朵银；责任编辑：张睿梅。点击下方阅读原文即可查看全文。图片来源于文章原文及摄图网。