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最新项目文章|菊花高密度遗传图谱构建和花瓣性状QTL定位|群体遗传专题

来源：花匠小妙招时间：2024-10-11 02:09

2020年7月2日，由联川生物服务的菊花高密度遗传图谱构建和QTL定位文章成功在Horticulture Research杂志online。本次微信仅做重要内容的文献解读，稍后我们会进行一场直播，重点为大家分享文章背后的故事和投稿返修的过程。

前言

花型是所有观赏植物最重要的质量性状之一。菊花中，辐射状小花和管状小花变异丰富，导致花型也千变万化。不同菊花类型的构成因子也复杂多样，其中花瓣瓣型和辐射状小花的数量是两个重要的构成因子。然而，由于缺少对花型发育的分子上的认知，直接对花型进行选择育种是一个巨大的挑战。该课题组之前的研究定义重瓣花为辐射状小花的数量（RNRF），辐射状小花花型定义为花冠筒合程度（CTMD），且发现这两个复杂的性状是数量性状，符合单主效基因和微效多基因模型。菊花品种改良时，高重瓣性和高程度的管状结构是两个重要的育种目标，因为这种类型菊花往往具有长的花期和采后储存时间。

菊花是一种自交不亲和的观赏植物，其基因组杂合度高，而且往往伴随着复杂的倍性。遗传图谱尤其是高密度的遗传图谱构建难度较大，目前有2个基于普通的RAPD等标记构建的遗传图谱，分子标记数量在597和1067个。还有一个包含30,312个SNPs的高密度遗传图谱成功构建，对花色，开花期和辐射状小花数量均进行了QTL定位。但是对RNRF和CTMD表型的高分辨率QTL定位尚未见报道。

本文通过简化基因组测序和拟测交原理构建了菊花高密度的遗传图谱，并基于2年的RNRF和CTMD表型数据QTL定位。同时，为了进一步发掘潜在的候选基因，我们把QTL区间的SNP 标记比对到菊花同科的向日葵和生菜的基因组上，期望通过近缘物种基因组的共线性关系发现候选基因的线索。继续将SNP标记比对到已经发表的野生菊花的RNAseq数据寻找潜在的候选基因。

材料和方法

利用Candy和225作为双亲，杂交后构建了包含305个个体的F1分离群体。双亲的花表型如下图（左为candy，右为225）。2年观察发现双亲的表型稳定。核型和流式细胞术暗示双亲均为六倍体。F1表型和双亲的13个性状分别在2015年和2016年得到鉴定，具体的表型鉴定方法参见原文。取幼嫩叶片提取基因组DNA后构建简化基因组测序文库。

图1 双亲的花型表现

SNP calling和遗传图谱构建

数据过滤后形成Clean data。然后基于BLAT比对，下一步在双亲和子代中进行SNP calling。去除掉非二等位的SNP，过滤掉深度10X以下的SNP后进行8种遗传分离pattern确定，去除aaxbb型的SNP，经过完整度70%、显著偏分离标记（p<0.01）过滤后，剩余SNP用来进行的遗传图谱构建。MapQTL 6的IM模型用来定位13个性状的QTL，阈值采用PT1000次检验或者LOD=3。为了验证SNP的准确性，作者在CTMD的QTL里筛选了15个SNP，在80个F1群体中进行genotyping。

候选基因筛选

首选进行菊花遗传图谱和向日葵、生菜基因组的共线性分析，提取RNRF和CTMD表型QTL中对应的向日葵和生菜基因组共线性片段，并依据基因组注释信息中的基因GO和KEGG注释筛选基因。在已经发表的菊花转录组数据中也进行类似的操作。

重要结果分析

1. 基本数据呈现

测序的数据展示（表1），本文的亲本测序深度均超过50X，子代测序深度超过20X，在3年之前能做到这个程度的case真心不多，高深度的数据为SNP 和遗传图谱构建打下坚实基础。

高密度遗传图谱和特征（图2）。利用拟测交的原理构建了菊花包含6452个标记的遗传图谱，包含27个连锁群，覆盖4301.5 cM，平均分辨率为0.76 cM。另外我们偏分离过滤标准为p＜0.01（极显著），在0.05-0.01之间的标记为显著偏分离，我们仍然进行了这部分数据的统计（不惧亮出弱点）。

图2 高密度遗传图谱

2. SNP的验证

当时设计这个part的时候犹豫了很长时间，因为一方面，简化基因组测序的SNP准确性普遍不如重测序（无参的菊花有点吃亏），另外，即使是重测序，KASP确实也存在验证率的问题。最后就是KASP项目一般是面向有参物种的，当时公司层面，无参物种并未开展过。这三点给我们心理上带来了一定的压力。好在我们准备工作充分，最终筛选的15个SNP中，有10个通过了验证，成功验证的SNP中，能准确分型的位点占比达95%。

3. QTL定位结果

QTL定位结果非常不错，13个性状有123个QTLs，有12个QTL的PVE超过10%。92个QTL两年能重复检测到。核心性状CTMD和RNRF定位结果也不错。CTMD共定位到16个QTLs，其中有3个主效QTLs，PVE分别为13.10%，31.90%和39.40%。RNRF表型有三个不同的计算方法，总共定位到34个QTLs，其中4个为主效。第一个仅仅定位到一个QTL，第二个定位到19个QTLs，第三个定位到15个QTLs。四个主效QTL的PVE分别为10.10%，11.30%，13.10和64.60%。

图3 CTMD性状的QTL定位

图4 CTMD的主效QTL

图5 RNRF的QTL定位

图6 主效RNRF的QTL定位

4. 候选基因挖掘

由于没有参考基因组的加持，无参物种候选基因筛选困难重重，本部分以近缘物种的共线性为突破口，借力其他有参物种和已经发表的数据。首先进行了遗传图谱和向日葵基因组（染色体水平），生菜基因组（非染色体水平）的共线性分析。和向日葵参考基因组比对发现，遗传图谱上的150个SNP可以比对到向日葵参考基因组上。所有QTL中有98个标记能锚定到向日葵参考基因组上，其中CTMD表型QTL对应的基因有3个，RNRF有5个。和生菜基因组比对发现，仅仅0.12%的标记能比对到生菜基因组。在比对到的CTMD和RNRF QTL的scaffold上，分别有12和8个基因。针对C. seticuspe的参考基因组和两个野生菊花转录组的数据做了同样的比对分析，得到了一些潜在的候选基因。

图7 菊花遗传图谱和向日葵基因组的共线性分析

靠谱er点评：本文的思路方法十分严谨，在遗传图谱构建和QTL定位上与其他物种F1群体并无二致，但是出彩之处在于：

1. 虽然本文研究的菊花是无参物种，但是充分利用了同科有参物种的基因组信息和同属不同种的菊花转录组测序信息，在丰富了文章内容的同时，将无参物种千篇一律的QTL定位延伸到候选基因的高度，虽然离候选基因还有一段差距，但是却迈出了重要的一步（此处应该有掌声）。

2. 对重要性状的QTL内SNP进行KASP验证，一方面验证了SNP的准确性，另一方面通过验证的SNP有望成为紧密连锁分子标记用于MAS育种。当时无参物种KASP验证实验的开展我们还是背负了一定的压力，好在高的测序深度和严格的数据过滤标准给了我们一定的信心，最终结果经受住了考验。

3. 文章中的图片颜值颇高，一篇好的paper必须是图文并茂。在此推荐华为P40高清拍照手机，5000万像素的超感知徕卡三摄，还原每个细胞的颜值（任总记得找小胡要下靠谱er的银行卡）。最后一个题外话是文章规避掉了一些潜在的坑，比如本文的材料是六倍体，复杂的倍性，尤其是同源性会给遗传图谱构建带来巨大的挑战，因此本文并未围绕这个点展开工作。

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