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一种有效观察番茄根结巨型细胞石蜡切片方法与流程

来源：花匠小妙招时间：2025-10-29 12:39

本发明涉及显微观察植物样品技术领域，尤其涉及一种植物组织石蜡切片方法，具体涉及一种有效观察番茄根结巨型细胞石蜡切片方法。

背景技术：

根结线虫(meloidogynespp.)是世界范围内危害巨大的土传病虫害之一，可侵染2000多种植物，给全世界的果树、蔬菜和粮食生产带来巨大的损失，是最普遍和重要的农作物线虫病害(冯志新，2001)。根结线虫为植物根部内寄生线虫，生活在土壤表层的5-30cm范围内。一般情况下在平均温度28℃时，作物生长季中完成整个生活史需要25天，一个生长季节可以繁殖3-4代，每一代的繁殖量较大，平均每条雌虫可产生300-500个卵(刘维志，2000)。根结线虫的二龄幼虫侵染植物根部后，进入根的皮层并在细胞间隙中移至根尖伸长区的维管组织找到合适的定居点，诱导植物维管组织细胞重新分化成巨型细胞并产生瘤状的根结。根结线虫固着寄生在植物体内，从巨型细胞内吸收水分和营养，生长发育为成虫，直到完成整个生活史(bird,1996)。根结的形成阻断了植株对水分和养分的正常运输与吸收，导致植株生长发育不良(文廷刚等，2008)，引起作物减产。因此，控制根结线虫的种群数量十分重要。

目前对作物根结线虫病的防治较为困难。随着分子生物学技术的日趋成熟，通过分子生物学技术深入研究根结线虫与其寄主植物巨型细胞的分子互作机理，培育新型的转基因抗线虫作物，从根本上切断根结线虫的侵染途径，从而对根结线虫进行防治是当前努力的目标，因此揭示植物根结巨型细胞的发育过程至关重要。

巨型细胞的发育过程常常需要用到石蜡切片技术。石蜡切片是植物学研究中常用的一种实验技术，为植物组织细微结构的观察作出重大贡献。石蜡切片是常规切片技术中应用最为广泛的技术之一，制成的玻片标本能够长期保存是其最大的优点，在组织学和病理学中得到了广泛应用(王秀文，2015)。一张质量优良的切片必须具备完整、组织面平整、厚薄适当、染色清晰和反差强的特点(廖秋萍等，2006)。石蜡切片法沿用多年，已经形成较为成熟的操作步骤，但在制作石蜡切片时，也会遇到脱片、切片碎裂、蜡带不连续、切片褶皱、染色效果不佳、模糊不清及细胞结构染色对比不明显等现象，极其影响后期观察。石蜡切片中每一环节都具相关性，环环相扣，制作出优质切片，每一步都至关重要，任何一个环节操作不规范都有可能影响最终的切片质量。影响片子质量的的因素有很多，不仅受组织本身特性的影响，还受标本的取材、组织块固定、脱水、包埋、浸蜡、切片、染色等因素的影响(wangetal.,2014)，因此需要针对每种材料的特点，建立适合的石蜡切片技术。

目前番茄基因组测序工作已经完成(tomatogenomeconsortium,2012)，番茄是一种理想的根结线虫寄主植物，建立易操作、质量高的番茄根结巨型细胞石蜡切片是一个需要解决的问题。目前仅袁林(2007)发表了番茄根结巨型细胞石蜡切片技术的研究结果，但是存在切片中番茄根结根结线虫变形和早期巨型细胞内含物缺失的现象；王磊(2011)仅发表了关于一个番茄根结巨型细胞摘要，未见图片效果，也未见后续论文发表。以前虽有其它植物根结组织石蜡切片的报道，但是，不同种类的植物组织有不同的特性，相关结果虽然有借鉴意义，却不能完全应用于番茄根结巨型细胞组织切片研究。所以发明了针对番茄根结巨型细胞石蜡切片的部分关键技术，并用于石蜡切片中。

技术实现要素：

本发明的目的在于提出一种有效观察番茄根结巨型细胞石蜡切片方法，该方法建立了包括取材、包埋方式以及挑片新技术，得到了符合要求的番茄根结巨型细胞石蜡切片。

本发明所采用的技术方案：一种有效观察番茄根结巨型细胞石蜡切片方法，包括如下步骤：

s1：将待切片的根结放置流水下清洗干净，将根结剪成1.0-1.5cm小段；

s2：准备医用针筒，用手指按住针头插孔，将根结放入针筒中，倒入faa固定液，插上针头及针筒并使针头朝上，反复推拉，直至观察到faa固定液中无气泡产生为止，此时根结中的空气已被抽出；

s3：抽真空结束后，将根结放入玻璃固定瓶中，加入faa固定液浸泡，加入量沒过根结组织即可；固定20-24h后即可进行下一步石蜡切片操作，如暂时还未进行后续实验，可放置4-6℃冰箱进行保存；

s4：准备纱布包裹根结，并用棉线扎住纱布封口，然后用橡皮筋将纱布固定在离心管上，放置在流水下冲洗24h；

s5：将根结放入离心管中，加入10-15ml，2％丙酸，浸泡2d；

s6：将根结放入离心管中，加入2％丙酸溶液与爱利氏苏木精染液的混合液染色，混合液比例为2:1，浸泡4d；

s7：染色后根结需再次进行流水冲洗，冲洗时间为24h，最后用蒸馏水浸泡0.5h-1h；

s8：准备离心管进行脱水，每次脱水前用纱布吸干根结上的水分，按照15％、30％、50％、70％、80％、95％乙醇浓度逐级各脱水一次，每次1.5h；最后进行无水乙醇脱水两次，每次各60min；

s9：准备若干个离心管，在离心管中加入20ml无水乙醇与5ml氯仿的混合液浸泡根结，时间30min，后逐次吸出5ml混合液，再加入5ml纯氯仿，如此反复4次，每次30min，最后再换上纯氯仿15ml，浸泡20min；

s10：往装有15ml纯氯仿浸泡根结的离心管中，加入熔化的石蜡，每次加入5ml纯石蜡，一共三次，每次浸蜡时间为1h；每次加蜡后立即将离心管置于38℃-40℃恒温水浴锅中，避免石蜡凝固，三次加蜡完成后继续将离心管置于38℃-40℃恒温水浴锅中浸蜡2～3d；然后按照1/2二甲苯加1/2石蜡浸泡根结，置于42℃恒温水浴锅中45min；接着1/4二甲苯加3/4石蜡浸泡根结，置于48℃恒温水浴锅中45min；最后利用纯蜡浸泡根结，置于58℃恒温水浴锅中60min，纯蜡浸泡需重复三次；

s11：取出根结置于58℃展蜡台，使根结材料周围的蜡块熔化；往预先折叠好的包埋模具中倒入纯石蜡，温度58℃-70℃，避免组织烫坏发生皱缩，用镊子将根结置于包埋模具蜡液中间位置，在蜡液未凝固之前调整好根结包埋角度，如果包埋样本过大，要保证各个根结材料之间有一定距离，以便于后期蜡块修整；包埋完成后静待石蜡在自然温度下凝固，卸下包埋模具；

s12：利用锋利刀片将石蜡块修整为小长方体，用力不宜过猛，导致石蜡块切碎；小长方体六面要平整，根结材料四周要留有多余的石蜡，不能使根结材料组织暴露于石蜡外；

s13：将修好的石蜡黏在小木块上，固定于手动轮转式切片机上，设置好切片厚度；切片过程中，摇动切片手柄的力度要适当，速度均匀一致，切片动作保持轻缓，不宜用力过度，否则会导致石蜡不成型且皱褶甚至石蜡破碎；从开始切片时，就用计数器进行计数，并记下刀位数，切至观察到石蜡中无根结组织出现为止，连片的石蜡需提前区分好组织正反面，用镊子小心轻缓放置于贴片板上，反面朝下，备用；

s14：贴片前，根据切片总刀数，取总刀位数除以2的前后10片进行贴片；首先用hcl浸泡载玻片24-48h，再用流水清洗干净，以确保载玻片无杂质进而影响后期观察；然后在载玻片上均匀涂抹10-15μl0.2％聚乙烯亚氨，备用；每张载玻片上滴一滴纯水，利用锋利刀片切断石蜡，每十刀石蜡一组，放置到载玻片上，反面朝下；

s15：将带有石蜡的载玻片置于38-40℃的展蜡台上，保持温度不变，烘烤3-5h，烘干表面水分；

s16：将载玻片放入to型生物制剂中，脱蜡50min，直至置于显微镜下观察到植物根结组织结构清晰即可；

s17：脱蜡后将载玻片稍微晾干3-5min，用枪头沾取中性树脂胶，快速滴于含有植物组织的位置，并倾斜放下干净的盖玻片即可；

s18：将已封片的玻片置于光学显微镜下进行观察，并拍照保存。

步骤s1所述的根结，为按照植物根组织生长方向将根结两端剪成上端0.3-0.5cm长和下端0.7-0.9cm长，根结形态为一边膨大，膨大角度以根结中柱与根组织中柱的夹角进行衡量，夹角范围是40～60°。

步骤s11中，向根结膨大的反方向倾斜45°放置在蜡液中，使植物根组织中柱与包埋模具的长边相交45°，包埋完成后等待石蜡在自然温度下凝固，卸下包埋模具。

步骤s13中，每个根结共切200-250刀，挑取每个根结切片总刀数的中位置前后10刀，此时能够挑到包含根结线虫虫体和最多巨型细胞切片。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

本实验中主要从取材、包埋角度和最佳切片序列号获得3个方面对切片优化进行了改进，分析了不同因素对片子质量的影响。

(1)步骤s1中，在取材方面进行了改进。取材是石蜡切片的起始步骤，如何取材直接影响到后续的实验和最终片子的质量。传统的石蜡切片在取材方面并没有明确的要求，只需要大小能浸没在faa固定液中利于切片机切片。由于传统石蜡切片在标本的选材方面没有严格要求，无法排除重复侵染的根结，对实验结果有一定影响，所以在取材方面要严格。因此本实验中植物根结的取材应为单一侵染的根结，收集植物根结时按照植物根组织生长方向将根结两端剪成上端1cm下端1.5cm，以保证测量雌根结线虫侵染角度的方向性与准确性。结果显示此取材方法的改进比传统石蜡切片切出的片子质量更高。

(2)步骤s11中，在切片包埋的角度方面进行了改进。石蜡切片包埋的角度决定了植物根结能否切出具有完整的雌根结线虫及结构清晰、数量达到最多的巨型细胞的片子。若要观察根结线虫侵染寄主植物后具有完整结构的梨形根结线虫与不同侵染天数的巨型细胞的组织病理结构，那么切片包埋的角度至关重要。经生物学统计番茄根结膨大形态主要为一边膨大，且一边膨大根结形态的雌根结线虫侵染角度测量结果主要集中在40-60°，故而一边膨大的植物根结石蜡切片可采用的包埋角度方法为向其膨大的反方向倾斜45°放置在蜡液中包埋，可使植物根组织中柱与长方形包埋模具的长边相交约45°，切片角度采用横切，优化后的片子呈现出结构完整的梨形根结线虫，根结线虫头部附近分布着若干个巨型细胞；而两边膨大的植物根结在进行石蜡切片前如未经过次氯酸钠-酸性品红染色法进行染色，无法用肉眼判断根结线虫是侵染在植物根组织中柱的左侧还是右侧，所以无法确定知道雌根结线虫侵染位置，难以获得具有完整结构的梨形根结线虫与巨型细胞的理想片子。因此，两边膨大的植物根结只有通过依据根结两边膨大的程度来提高获得理想片子的几率，通过次氯酸钠-酸性品红染色法观察结果显示部分两边膨大的植物根结两边膨大程度不一样，可采用以膨大程度比较明显的那侧为主，采用向其膨大的反方向倾斜45°放置在蜡液中的包埋角度，使植物根组织中柱与长方形包埋模具的长边相交约45°，切片角度同样采用横切，即可获得具有完整结构的梨形根结线虫与巨型细胞的理想片子。因此，本实验最终以优化后的切片包埋角度进行巨型细胞和根结线虫的组织病理结构观察。

(3)步骤s13中，观察并统计出最优切片刀数。石蜡切片每一张片子都能观察到细胞组织结构，但是想要观察到完整虫体和多个巨型细胞必须将所有玻片在显微镜下观察。若观察的不仔细就不能找到理想的片子。本实验番茄根结巨型细胞以及根结线虫从产生到消失的整个过程观察，可知一个完整的根结石蜡切片有200-250刀左右，每刀10μm，最开始几十刀通常是正常植物根组织，接着先出现巨型细胞，中间位置的片子会同时出现多个巨型细胞与完整根结线虫虫体，然后巨型细胞与根结线虫从大到小，逐渐消失，最后的几十刀则是正常的植物根组织。因此本研究采用优化后的包埋角度进行石蜡切片制作，对不同侵染天数番茄根结每一刀切片出现巨型细胞的个数以及虫体的完整性进行观察统计，结果显示最佳切片序列号出现在全部切片刀数中位置前后十刀，此时能够切到完整的根结线虫虫体，巨型细胞的个数达到最多。而传统的石蜡切片技术必须将所有的包埋好的石蜡标本进行切片后，然后在倒置显微镜下按顺序一一观察，才能找到巨型细胞最多与线虫虫体完整的玻片。这样不仅消耗大量的时间和精力，而且增加了工作量。筛选出的最优切片刀数克服了以往实验中的不足，能快速的进行观察和组织病理学分析。

附图说明

图1番茄根结巨型细胞石蜡切片包埋模式图；

图2番茄根结巨型细胞石蜡切片效果图；

图3不同侵染天数番茄根结巨型细胞最佳切片序列号图；

图4不同侵染天数番茄根结巨型细胞形态特征图。

具体实施方式

下面结合具体实施例进一步说明本发明的技术方案。

一种有效观察番茄根结巨型细胞石蜡切片方法，包括如下步骤：

s1：将待切片的根结放置流水下清洗干净，将根结剪成1.0-1.5cm小段；

s4：准备纱布包裹根结，并用棉线扎住纱布封口，然后用橡皮筋将纱布固定在离心管上，放置在流水下冲洗24h；

s5：将根结放入离心管中，加入10-15ml，2％丙酸，浸泡2d；

s6：将根结放入离心管中，加入2％丙酸溶液与爱利氏苏木精染液的混合液染色，混合液比例为2:1，浸泡4d；

s7：染色后根结需再次进行流水冲洗，冲洗时间为24h，最后用蒸馏水浸泡0.5h-1h；

s15：将带有石蜡的载玻片置于38-40℃的展蜡台上，保持温度不变，烘烤3-5h，烘干表面水分；

s16：将载玻片放入to型生物制剂中，脱蜡50min，直至置于显微镜下观察到植物根结组织结构清晰即可；

s17：脱蜡后将载玻片稍微晾干3-5min，用枪头沾取中性树脂胶，快速滴于含有植物组织的位置，并倾斜放下干净的盖玻片即可；

s18：将已封片的玻片置于光学显微镜下进行观察，并拍照保存。

步骤s13中，每个根结共切200-250刀，挑取每个根结切片总刀数的中位置前后10刀，此时能够挑到包含根结线虫虫体和最多巨型细胞切片。

实施例一：

一种有效观察番茄根结巨型细胞石蜡切片方法，包括如下步骤：

s1：接种后，将番茄根部的泥土在流水下冲洗5min，收集根部根结形态为一边膨大，侵染角度为40～60°的根结，放在faa固定液中保存(注意：收集植物根结时按照植物根组织生长方向将根结两端剪成上端0.3cm下端0.7cm)；

s2：准备10ml医用针筒，用手指按住针头插孔，将收集的根结放入针筒中，倒入8ml的faa固定液，插上针头及针筒并使针头朝上，反复推拉，直至观察到固定液中无气泡产生为止，此时根结中的空气已被抽出；

s3：抽真空结束后，将根结放入玻璃固定瓶中，加入faa固定液浸泡，加入量沒过根结组织即可；固定24h后即可进行下一步石蜡切片操作，如暂时还未进行后续实验，可放置4℃冰箱进行保存；

s4：准备10cm*10cm的纱布包裹根结，并用棉线扎住纱布封口，然后用橡皮筋将纱布固定在50ml离心管上，放置在流水下冲洗24h；

s5：将根结放入50ml离心管中，加入10ml，2％丙酸，浸泡2d；

s6：将根结放入50ml离心管中，加入2％丙酸溶液与爱利氏苏木精染液的混合液，混合液比例为2:1，浸泡4d；

s7：染色后根结需再次进行流水冲洗，冲洗时间为24h，最后用蒸馏水浸泡30min；

s8：准备50ml离心管进行脱水，每次脱水前用纱布吸干根结上的水分，按照15％、30％、50％、70％、80％、95％乙醇浓度逐级各脱水一次，每次1.5h；最后进行无水乙醇脱水两次，每次各60min；实验中要保证每一级乙醇浓度的准确性，如乙醇配制时间过长，需重新配置，以免浓度不准导致材料脱水不彻底；

s9：准备若干个50ml离心管，在离心管中加入20ml无水乙醇与5ml氯仿的混合液浸泡根结，时间30min，后逐次吸出5ml混合液，再加入5ml纯氯仿，如此反复4次，每次30min，最后再换上纯氯仿15ml，浸泡20min；

s10：往装有15ml纯氯仿浸泡根结的离心管中，加入熔好的石蜡，每次加入5ml纯石蜡，一共三次，每次浸蜡时间为1h；每次加蜡后立即将离心管置于38℃-40℃恒温水浴锅中，避免石蜡凝固，三次加蜡完成后继续将离心管置于38℃-40℃恒温水浴锅中浸蜡2～3d。然后按照1/2二甲苯加1/2石蜡浸泡根结，置于42℃恒温水浴锅中45min；接着1/4二甲苯加3/4石蜡浸泡根结，置于48℃恒温水浴锅中45min；最后利用纯蜡浸泡根结，置于58℃恒温水浴锅中60min，纯蜡浸泡需重复三次；

s11：将浸蜡完成根结材料放置在展蜡台上，使根结材料周围的蜡块熔化；往预先折叠好的长方形包埋模具中倒入纯石蜡，温度不宜超过70℃，避免组织烫坏发生皱缩，用镊子将根结取出放置在包埋模具中间的蜡液里，在蜡液未凝固之前调整好根结包埋角度，放置方法为：将根结形态为一边膨大的浸蜡组织块，向其膨大的反方向倾斜45°放置在蜡液中，使植物根组织中柱与长方形包埋模具的长边相交约45°，具体包埋模式图(如图1所示)；如果包埋样本过多，要保证各个根结材料之间有一定距离，以方便后期的蜡块进行修整完善；包埋完成后等待石蜡在自然温度下凝固，卸下包埋模具；

s12：将石蜡块用锋利刀片将长方形组织蜡块去掉边缘多余的蜡，修整成同样比例的小六面体，不宜用力过猛，将石蜡块切碎；小长方体六面要平整，材料四周要留有多余的石蜡，不能使材料组织暴露在石蜡外；然后用融化好的石蜡将小蜡块固定在切片板上，用于后期切片；

s13：将修好的蜡块黏在小木块上，固定于leicarm2235型手动轮转式切片机上，设置好切片厚度，进行横切。切片过程中，摇动切片手柄的力度要适当，速度均匀一致，切片动作保持轻缓，不宜用力过度，否则会导致蜡带不成型且皱褶甚至蜡块破碎；切至观察到蜡带中无根结组织出现为止，连片的蜡带需提前区分好组织正反面，用镊子小心轻缓放置于贴片板上，反面朝下(蜡带光滑且反光的蜡面为反面)，备用；

s14：贴片前，用hcl浸泡载玻片24h，再用流水清洗干净，以确保载玻片无杂质进而影响后期观察；然后在载玻片上均匀涂抹10μl0.2％聚乙烯亚氨，备用；每张载玻片上滴一滴纯水，利用锋利刀片切断蜡带，每十刀蜡带一组，放置到载玻片上，反面朝下(蜡带光滑且反光的蜡面为反面)；

s15：将带有蜡带的载玻片置于38-40℃的展蜡台上，保持温度不变，烘烤5h，烘干表面水分；

s16：将载玻片放入to型生物制剂中，脱蜡50min，直至置于显微镜下观察到植物根结组织结构清晰即可；

s17：脱蜡后将载玻片稍微晾干3min，用枪头沾取中性树脂胶，快速滴于含有植物组织的位置，并倾斜放下干净的盖玻片即可；

s18：将已封片的玻片置于光学显微镜下进行观察，并拍照保存。

步骤s13中，每个根结共切200-250刀，挑取每个根结切片总刀数的中位置前后10刀，此时能够挑到包含根结线虫虫体和最多巨型细胞切片。

以本实施例的包埋方法，可以容易切出既含有巨型细胞又含有完整虫体的番茄根结巨型细胞切片图(见附图2)。

实施实例二：不同侵染天数番茄根结最佳切片序列号的获得。

本实施实例按照实施例1所述的方法，具体为获得不同侵染天数番茄根结最佳切片序列号。

本实施实例是根据实施例1的步骤，收集7d、14d、21d、28d和35d番茄根结，进行切片制作。其中每个天数各取6个有效根结进行切片，采用nikoneclipsets100倒置显微镜拍照记录番茄根内巨型细胞以及根结线虫从产生到消失的整个过程，并对6个有效根结每一刀切片出现巨型细胞的个数以及虫体的完整性进行观察并统计。实施实例结果表明：每个根结大约共切220刀，其中220刀切片中1刀～90刀至151刀～220刀切片中几乎不会出现巨型细胞以及根结线虫虫体，而91刀～150刀切片会逐渐出现巨型细胞以及根结线虫虫体，获得的最佳切片序列号结果显示：巨型细胞个数以及根结线虫虫体的完整度均呈正态分布，最佳切片序列号位置在每个根结切片总刀数的中位置前后10刀左右(切片中位置＝总刀数/2)，此时能够切到完整的根结线虫虫体，巨型细胞的个数达到最多(见附图3)。如侵染番茄7d、14d、21d、28d的切片效果图所示，可见每张切片中均含有清楚细胞核的巨型细胞和根结线虫(见附图4)。

对于本领域的技术人员来说，可根据以上描述的技术方案以及构思，做出其它各种相应的改变以及变形，而所有的这些改变以及变形都应该属于本发明权利要求的保护范围之内。