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一种鉴定不同品种油菜抗蚜性的方法与流程

来源：花匠小妙招时间：2025-10-28 03:24

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种鉴定不同品种油菜抗蚜性的方法。

背景技术：

油菜属十字花科芸薹属，目前生产上栽培的有三种类型：甘蓝型、芥菜型和白菜型油菜。油菜是仅次于谷类作物的世界第二大食物能源，是世界上大豆和棉花之后第三个主要的可食用油资源。

然而，油菜生长期常常受到病虫害的影响，制约产量的增加。大量的病虫害侵袭，造成油菜大面积毁种和缺苗断垄，严重影响油菜生长。在作物生长过程中，受到十字花科害虫和病原体的侵害，并且近些年入侵率持续增加，使油菜的产量受到严重的制约。其中，影响最大的虫害就是蚜虫。蚜虫是油菜上的重要害虫，是刺吸式口器的代表性昆虫，取食植物时将口针刺入植物组织表皮细胞和薄壁细胞间，插入筛管内，口针分泌出胶状唾液和水状唾液保护口针并且防止植物组织愈合，从而可以长时间不断地取食植物韧皮部汁液，获得碳水化合物，氨基酸，矿物质，维生素以及大分子物质。在生长初期，蚜虫多集中于油菜叶背或嫩叶部取食，造成叶片变色、卷曲以及褶皱；在开花结角期，该虫多群集于花蕾、花梗或荚果处，造成花梗扭曲，荚果畸形，从而出现有花不能结角，有果籽不实的现象，严重时可造成植株死亡，而且蚜虫还可以增加病毒传播。

到目前为止，抗虫油菜品种还没有商业化。农民倚赖杀虫剂来抑制蚜虫，但选择压导致蚜虫已经对许多杀虫剂产生了抗性。此外，杀虫剂对环境的消极影响表明替代的防治策略和培育抗性品种是急需的。而培育抗性品种，首先要定位植株上的抗性因子，才能找到着手点。了解蚜虫探测和取食的行为对于研究植株对蚜虫的适应性，探索抗性因子有着重要的意义。

传统鉴定油菜抗蚜的方法都是以在室内和田间接种蚜虫之后，观察油菜植株的感蚜的情况来确定，需要花费大量的人力，物力和财力，而且还要长期在室内饲养蚜虫种群，如果不保存这些物种，需要从田间去采集，田间的蚜虫长期受到农药的影响，产生较大的抗药性，对实验的作物也会长期产生适应性，造成评估的不准确。而且受到气候的影响较大，如果不适发的年限，蚜虫及病毒病均不易采集到，实验也会受到影响。而且传统的方法人为地因素太多，需要大量的重复来降低人为的影响，实验数据也存在较大的变化，且不能根据实验结果知道潜在的抗性机理及深层的原因。并且传统的方法对蚜虫和病毒病的抗性鉴定需要各自进行接种鉴定，不能一同进行评估。

技术实现要素：

基于背景技术存在的技术问题，本发明提出了一种鉴定不同品种油菜抗蚜性的方法，通过利用电子穿刺图谱技术(electropenetrography/theelectricalpenetrationgraph，epg)来实现监测蚜虫在油菜植株上的取食行为，并在这一基础上，分析出不同品种油菜的抗蚜性大小。

为实现上述目的，本发明采取以下技术方案：

一种采集蚜虫对油菜取食行为的epg参数的方法，包括如下步骤：

(1)将甘蓝蚜用导电银胶将金丝一端固定于背部后，放置于繁育蚜虫的植株上过夜适应；同时选择油菜植株作为测试对象；

(2)将金丝的另外一端接到dc-epg系统上，同时将植物电极插入植株土壤中，再将饥饿处理后且连接金丝的甘蓝蚜置于油菜植株上，在法拉第笼中进行试验；

当甘蓝蚜的口针刺入植物组织时，由甘蓝蚜口针为微电极和植物根部土壤为参比电极构成的回路接通，获取甘蓝蚜在油菜植株上对应至少6h取食行为所产生的一系列电信号；

(3)将上述电信号经dc-epg系统放大处理后，转化成数字信号，再以波形数据的形式进行记录，获取蚜虫在油菜上对应取食行为的epg波形；

(4)将epg波形进行类比、分析以及认定，参照蚜虫取食行为与epg波形的对应关系，将epg波形划分为5种类型：口针在植株外部产生的非刺探波np，口针在表皮以及叶肉中穿刺、唾液分泌以及其它行为产生的路径波c，口针在细胞内穿刺产生的电势降pd，口针在韧皮部内分泌唾液产生的分泌波e1和口针在韧皮部取食产生的取食波e2；

(5)将上述epg波形包含的非刺探波np、路径波c、细胞内穿刺波pd、唾液分泌波e1、取食波e2对应的时间、次数进行统计、筛选，获得蚜虫对油菜取食行为的epg参数。

优选地，步骤(1)中，所述甘蓝蚜为新羽化2天的无翅甘蓝蚜；所述油菜植株为发育到4叶期的油菜植株；

步骤(2)中，所述饥饿处理的时间优选为1h。

优选地，步骤(2)中，所述dc-epg系统为荷兰wageningenuniversity生产的giga4型号的4通道的dc-epg系统；

优选地，所述dc-epg系统的一个通道只能连接一根长2cm，直径18μm的金丝，一根金丝也只能连接一头甘蓝蚜。

优选地，步骤(3)中，所述试验在室内、恒定光照以及25±1℃的温度下进行；

优选地，试验过程中，每株油菜植株与每头甘蓝蚜仅用于1次试验，至少取20次有效重复试验。

一种鉴定不同品种油菜抗蚜性的方法，包括如下步骤：

s1、采用不同品种的油菜植株作为测试对象，按照权利要求1-4任一项所述的方法，获取甘蓝蚜对各品种油菜植株取食行为的epg参数；

s2、对所述epg参数进行筛选，选择出与油菜抗蚜性鉴定相关性最强的一组epg参数进行研究；

s3、所述与油菜抗蚜性鉴定相关性最强的一组epg参数中，若与e1波相关的epg参数越大，与e2波相关的epg参数越小，表明该品种的油菜抗蚜性越强，反之则表明该品种的油菜抗蚜性越弱。

优选地，步骤s2中，所述与油菜抗蚜性鉴定相关性最强的一组epg参数包括：第一个e波之前非探测的持续期、开始到第一个e波的时间、探测的次数、探测的总时间、非探测的总时间、非韧皮部阶段的总持续期、开始到第一个e2波的时间、到第一次探测的时间、第一个e1波之前的探测次数、每次探测中pd波的平均发生次数、短暂探测(c波<3minutes)的次数、pd波的个数、pd波的总持续期、c波的总持续期、从探测开始到第一个e波的时间、从第一次探测开始到第一个pd波的时间、c波所占的百分比、e1波的个数、e1波占韧皮部阶段的百分比、后面接第一个持久e2波(>10min)的e1波的持续期、后面接持久e2波(>10min)的e1波的总持续期、潜在的e2波指数、e波的总持续期、e1波的总持续期、e2波的总持续期、最长e2波的持续时间、持久e2波(>10min)占e2波的比例、e1波占测试时间的百分比、e2波占测试时间的百分比。

优选地，步骤s3中，所述“与e1波相关的epg参数越大，与e2波相关的epg参数越小”具体为“e1波占韧皮部阶段的百分比越大”，即若e1波占韧皮部阶段的百分比越大，表明该品种的油菜抗蚜性越强，反之则表明该品种的油菜抗蚜性越弱。

优选地，步骤s3中，所述“与e1波相关的epg参数越大，与e2波相关的epg参数越小”具体为“e2的总持续期越小”，即若e2的总持续期越小，表明该品种的油菜抗蚜性越强，反之则表明该品种的油菜抗蚜性越弱。

优选地，步骤s3中，若短暂探测的次数(即持续时间＜3min的路径波c的次数)越多，c波的总占比越高，表明该品种油菜抗蚜性越强，反之则表明该品种的油菜抗蚜性越弱。

优选地，步骤s3中，若探测的总时间越长，非探测的总时间越短，表明该品种的油菜抗蚜性越弱；反之则表明该品种的油菜抗蚜性越强。

与现有同类检测方法相比，本发明具有以下优点：

(1)利用刺探电位图谱技术对不同品种油菜抗蚜性进行鉴定时，可直接以不同品种的油菜植株为测定对象，不用对植株进行其他处理。

(2)不仅克服了传统鉴定油菜抗蚜的方法所需的时间周期长、结果不稳定等缺点，还可以定位抗虫因子，为接下来的抗虫机理方面的研究奠定基础。

附图说明

图1为甘蓝蚜在秦优10上取食对应的epg波形(pd波和e波)展示；

图2亦为甘蓝蚜在秦优10上取食对应的epg波形(pd波和g波)展示。

具体实施方式

实施例1

甘蓝蚜在油菜上取食行为的epg监测：

(1)试验昆虫和油菜品种的准备

甘蓝蚜收集于浙江农科院蔬菜研究所种植油菜的温室中，在甘蓝brassicaoleraceavar.capitatal.上饲养超过一年。室内温度25±1℃，75±5％rh，16:8(l:d)光周期下饲养；收集最近两天羽化的无翅成虫用于实验。

油菜品种为安徽省农科院植物育种实验室提供的秦优10。植株种植于13cm直径的塑料花盆中，土壤为泥煤苔，蛭石，有机肥(n+p2o5+k2o≥2％，organicmatter≥40％，zhongnuo，huaian，jiangsu，china)和珍珠岩按照10:10:10:1的比例配成的混合物。植株置于25±1℃,75±5％rh和12:12(l:d)光周期下，常规浇水，但不再额外施肥。发育到4叶期的油菜植株用于实验。

(2)预处理蚜虫用于epg测定

用水溶性的电导银胶(electrolube，swadlincote，derbyshire，theunitedkingdom)将一根长2cm，直径18μm的金丝轻轻地粘附到新羽化的无翅蚜成虫的背部。固定后，蚜虫被放回繁育的植株上过夜。第二天早上的8点半开始，每头蚜虫饥饿1小时后，用于epg试验。

(3)监测蚜虫取食行为的epg试验

使用tjallingii(1988)修正的epg技术监测蚜虫行为。原理:将蚜虫及其取食的植物接入同一电路，蚜虫的口针作为电极，当口针刺破植物时电路闭合形成回路。在蚜虫取食过程中，蚜虫本身的电阻以及口针所在植物组织或细胞的电位都会发生变化。以时间为横坐标,测量电位vi为纵坐标输出的波形图就是epg的波形记录。

将蚜虫电极利用金丝连接到4通道的dc-epg系统(giga-4；epgsystems，wageningen，thenetherlands)上，使用probe3.5(hardwareandsoftwarefromepg-systems，wageningen，thenetherlands)记录epg输出的结果。在法拉第笼中，将饥饿处理后的蚜虫快速放到盆栽发育到4叶期的油菜植株成熟叶片的下表面中脉附近，将植物电极插入土壤中。当蚜虫口针刺入植物组织时，整个回路接通，回路电流经生物电流放大器放大后在输出端输出一系列不同的电流信号。该系统可以同时在4棵分开的植株上检测4头蚜虫的取食行为。每次记录中蚜虫和植株只被使用一次。根据我们的预备实验，每次记录持续6h，每个处理进行20次重复，整个实验在室内恒定光照和25±1℃下进行。

(4)epg试验的数据记录

epg波形通过口针在植株中的位置来定义，复杂的口针行为如表1所示。波形以可区分的形式被分组，功能上相关的行为主要分成四个行为阶段：叶表，表皮-叶肉，叶肉以及韧皮部阶段。波形解释如下：(i)非探测(np波形：口针在植株外部)；(ii)路径期(c波形：包括穿刺，唾液分泌以及其它在叶肉中的行为；pd波形：电势降，意味着路径期间的细胞内穿刺)；(iii)韧皮部阶段(e波形：包括e1波形代表着韧皮部筛管分子中的唾液分泌以及e2波形代表着韧皮部摄食)(tjallingii,1986；pelletierandgiguere,2009；heetal.,2013)。

(5)分析结果

经过我们的预实验，分析后发现与甘蓝蚜在油菜上取食相关的参数主要有93个，就该93个参数对甘蓝蚜在秦优10上的取食行为进行研究，结果如下表1所示

表1甘蓝蚜在秦优10上的取食行为epg参数

由表1可见，有些波形在我们所测试的时间内并未测试到，但大多数波形都存在，根据不同的实验设计及实验目的，波形的出现可能会不同，但基本都在以上的93个参数中。部分波形图如图1(时间为横坐标，测量电位vi为纵坐标)所示：

图1、2中，序号1对应的波形图为整体波形；序号2为pd波；序号3为pd波；序号4为pd波加e波；序号5为e1+e2波；序号6为e2波；序号7为完整probe前段；序号8为pd波加e波；序号9为g波；序号10为加大的g波。

由表1可知，甘蓝蚜在秦优10上出现了典型的蚜虫取食波，也即甘蓝蚜在油菜植株上的取食行为可以通过epg技术很好的反映出来，而且不同组织部位蚜虫所具有的不同行为特征对于详细了解蚜虫的取食过程非常重要。

经过多次的预备实验，我们得出了上述提及的各项测试条件，用来测定甘蓝蚜在油菜植株上的取食行为epg参数是可行的。比如，测试时间，我们发现连续测试6h对于了解甘蓝蚜在油菜植株上的取食行为就已足够，也就是说6h是甘蓝蚜在油菜植株上取食的一个循环，更多的测试时间对结果没有明显的影响，反而会造成时间和精力的浪费。在进行epg研究之前，蚜虫饥饿1h，可以加快epg的开始进程，由于后续的实验是在相同条件下的比对，所以饥饿1h依然可以很好的辨别叶表的抗性水平。相反，如果不进行饥饿处理，蚜虫可能因为饱足感，迟迟不进行探测，不仅浪费时间而且还会造成叶表存在抗性的假象。我们还对119个与蚜虫相关的epg参数进一步的筛选，选出其中的93个参数，与甘蓝蚜在油菜上的取食行为相关性较大。根据不同的实验目的，可以从这93个参数中继续选择相关性更强的参数进行研究，以减少数据处理的强度，提高数据分析的精准度。但同时要注意，因个体的差异，要保证足够的重复次数，以精确处理数据。

实施例2

利用epg技术鉴定不同油菜品种的抗蚜性：

(1)试验昆虫和油菜品种的准备

油菜品种为安徽省农科院油料作物育种实验室提供的两个品种：德核杂油8，中油821。植株种植于13cm直径的塑料花盆中，土壤为泥煤苔，蛭石，有机肥(n+p2o5+k2o≥2％，organicmatter≥40％，zhongnuo，huaian，jiangsu，china)和珍珠岩按照10:10:10:1的比例配成的混合物。植株置于25±1℃，75±5％rh和12:12(l:d)光周期下，常规浇水，但不再额外施肥。发育到4叶期的油菜植株用于实验。

(2)预处理蚜虫用于epg测定

(3)监测蚜虫取食行为的epg试验

将蚜虫电极利用金丝连接到4通道的dc-epg系统(giga-4；epgsystems，wageningen，thenetherlands)上，使用probe3.5(hardwareandsoftwarefromepg-systems，wageningen，thenetherlands)记录epg输出的结果。在法拉第笼中，将饥饿处理后的蚜虫快速放到上述盆栽发育到4叶期的油菜植株成熟叶片的下表面中脉附近，将植物电极插入土壤中。当蚜虫口针刺入植物组织时，整个回路接通，回路电流经生物电流放大器放大后在输出端输出一系列不同的电流信号。该系统可以同时在4棵分开的植株上检测4头蚜虫的取食行为。每次记录中蚜虫和植株只被使用一次。根据我们的预备实验，每次记录持续6h，每个处理进行20次重复，整个实验在室内恒定光照和25±1℃下进行。

(4)epg试验的数据记录

epg波形通过口针在植株中的位置来定义，复杂的口针行为如表2所示。波形以可区分的形式被分组，功能上相关的行为主要分成四个行为阶段：叶表，表皮-叶肉，叶肉以及韧皮部阶段。波形解释如下：(i)非探测(np波形：口针在植株外部)；(ii)路径期(c波形：包括穿刺，唾液分泌以及其它在叶肉中的行为；pd波形：电势降，意味着路径期间的细胞内穿刺)；(iii)韧皮部阶段(e波形：包括e1波形代表着韧皮部筛管分子中的唾液分泌以及e2波形代表着韧皮部摄食)(tjallingii,1986；pelletierandgiguere,2009；heetal.,2013)。

epg特征参数由a/dcard(di-710format，dataqinstrumentsincorporated，theunitedstatesofamerica)记录。电流信号经stylet+软件转换为数字信号保存在电脑硬盘上，再用probe2.0软件转化成波形图像输出在电脑屏幕上供判读、分析用(tjallingii,1988)。使用sas9.2软件(sasinstituteinc.2008)进行数据统计分析，数据间的比较使用单因素方差分析中的lsd方法。时间类型数据在分析前进行自然对数转换，其中数据为0的，加1后再进行转化；频次数据在分析前进行平方根转化；百分比数据在分析前进行反正先平方根转化。两个处理间的比较使用studentt-test(gaussianvariables)或者mann-whitneyutest(fornon-gaussianvariables)。

(5)分析结果

在实施例1研究的基础上，通过相关性和主成分分析，继续筛选了与不同品种之间抗蚜性鉴定的相关性最强的29个epg参数(表2)，就该29个参数对甘蓝蚜在德核杂油8，中油821上的取食行为进行研究，基于各epg参数与抗性因子在植物特异组织中的关系与实际波形，甘蓝蚜在油菜上取食相关的epg参数可以分为总览性参数、叶表参数、叶肉参数以及与韧皮部参数几类。

结果如下表3-6所示：

表2不同品种之间抗蚜性鉴定的相关性最强的epg参数

结合上述epg参数与植物抗性因子之间的相关性，记录并分析甘蓝蚜在德核杂油8，中油821两个油菜品种上的总览性参数，结果如下表3所示：

表3甘蓝蚜在2个油菜品种上的总览性参数

注：数值后的不同*代表差异达到显著水平。

一般而言，总览性参数涵盖了超过一个阶段，或者展示对植物抗蚜性的整体印象。由表3可知，与中油821相比较，蚜虫在德核杂油8上的探测次数(n_pr)明显减少，总探测时间(s_pr)较长。而总的非探测时间(s_np)减少，第一个e波之前的非探测持续期(s_np.1e)以及非韧皮部阶段的总持续期(s_ne)明显短于中油821。t_1erec和t_1e2.rec则不受品种的影响。

结合epg参数与植物抗性因子之间的相关性，记录并分析甘蓝蚜在德核杂油8，中油821两个油菜品种上的叶表参数，结果如下表4所示：

表4甘蓝蚜在2个油菜品种上的叶表参数

开始第一次探测的时间(t_1pr)被认为是评估抗蚜性的关键因子，由表4可知，这一参数在德核杂油8和中油821之间没有显著差异。

结合epg参数与植物抗性因子之间的相关性，记录并分析甘蓝蚜在德核杂油8，中油821两个油菜品种上的叶肉参数，结果如下表5所示：

表5甘蓝蚜在2个油菜品种上的叶肉参数

注：数值后的不同*代表差异达到显著水平。

叶肉参数反应了不同品种油菜在路径期的变量，由表5可知，德核杂油8上短暂探测(c<3minutes)的次数(n_bpr)明显少于中油821。德核杂油8上每次探测中pd波的平均数(n_pd/n_pr)明显多于在中油821上的，然而，pd波的总持续期显著短于中油821。德核杂油8上的路径持续期所占的百分比显著低于中油821。路径期的其它参数不受品种的显著影响。

结合epg参数与植物抗性因子之间的相关性，记录并分析甘蓝蚜在德核杂油8，中油821两个油菜品种上的韧皮部参数，结果如下表5所示：

表6甘蓝蚜在2个油菜品种上的韧皮部参数

注：数值后的不同*代表差异达到显著水平。

e波是韧皮部阶段主要的波形，包括e1(代表唾液分泌)和e2(与摄食相关)。由表6可见，与中油821相比，蚜虫在德核杂油8上与e1相关的参数都显著较低，而与e2相关的变量值均明显更高。

综合上表3-6可知，甘蓝蚜虫在德核杂油8上花费最长的探测时间，最短的非探测时间，总体上表明蚜虫偏好在德核杂油8上取食。

蚜虫有时候穿刺植物组织，仅短暂的<30s。在这种行为期间，仅表皮细胞可能被穿刺。探测超过30s但短于3min，蚜虫可能不仅穿刺表皮，也穿刺了表层的叶肉细胞。口针穿刺的这个阶段，称为路径期。短暂探测的次数被认为是叶肉抗性的一个指示。短暂探测的次数越多，叶肉抗性越强。本研究显示，中油821上蚜虫短暂探测次数是德核杂油8上的3倍多。而与中油821相比，蚜虫在德核杂油8上穿刺细胞次数最多，穿刺细胞的时间却最短。路径期间，蚜虫几乎穿刺了每一个接触到的细胞。穿刺细胞的同时，蚜虫摄取细胞内容物，注射水溶性唾液，水溶性唾液被注射到胞腔中可能是为了适应取食的植株，因为蚜虫唾液已知含有大量的感受分子。穿刺细胞可能对定位筛管分子有作用。因此，可以认为蚜虫在德核杂油8的叶肉中通过频繁穿刺细胞来获得导向韧皮部的线索。尽管品种之间路径的总持续期是相似的，但在油821上c波的总占比显著高于德核杂油8，推测德核杂油8的叶肉中口针穿刺受到的阻碍相对较少，通过频繁，快速的穿刺细胞来导向到韧皮部，因为推迟到达韧皮部表明吸收韧皮部汁液很困难。

进行最初的寄主/非寄主选择后，影响蚜虫行为的植物因子更可能处于较深层的植物层中，包括韧皮部。我们的研究中，在德核杂油8上与e1相关的变量在品种间是最低的，包括d_e1followedby1se2,s_e1followedbyse2,s_e1,％_e1/e12,和％probtimeine1。特别是，中油821上的e1占韧皮部阶段的百分比是德核杂油8上的7倍多。波形e1与水溶性唾液的排出进入筛管分子相关。延长的e1唾液分泌常常被报道是蚜虫在抗性或非寄主植株上的特征行为。在筛管分子中分泌唾液可能对克服植物防御机制有作用。可以认为中油821的韧皮部抗性远大于德核杂油8。并且在德核杂油8上与e2相关的变量是最高的，中油821是最低的。epg结果显示植株对蚜虫的抗性会减少蚜虫在抗性植株上的韧皮部摄食期，说明蚜虫更加偏好吸食德核杂油8的汁液。中油821上蚜虫分泌较多的唾液，取食较少，可能在中油821中存在某些植物因子如取食抑制物，低的韧皮部汁液营养质量，或者位于筛管分子的植物因子，不适合蚜虫取食。

偏好性主要体现在摄取韧皮部汁液更长的时间，以及到达韧皮部筛管的时间更短，综合结果可以看出，相比中油821，甘蓝蚜更偏爱在德核杂油8上取食。

电子穿刺图谱技术的结果显示蚜虫不同的探测行为在时间，频率以及比例中的差异依赖于测试的油菜品种，并且在植物组织的不同位置(表皮，叶肉和韧皮部)和叶片表面存在抗性。但作为以韧皮部汁液为食的蚜虫，韧皮部的抗性应该是区分品种适合性的最重要因子。

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。