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一种测定拟南芥离体花粉萌发率的方法

来源：花匠小妙招时间：2025-09-27 07:04

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种测定拟南芥离体花粉萌发率的方法。

背景技术：

拟南芥(arabidopsisthaliana)是重要的模式植物，具有个体小、生殖周期短、种子量大等特点。此外，拟南芥基因组大小适中，基因纯合度高，且存在丰富的突变体材料，是开展植物功能基因组研究的理想材料。拟南芥具有典型的完全花结构，其花粉管的萌发和生长是植物有性生殖过程中的重要事件，长期以来一直是植物生殖生理与分子生物学研究的热点领域；花粉的正常萌发和花粉管伸长也是研究植物细胞极性生长、分化以及信号转导的重要体系。花粉离体萌发实验是体外检验花粉粒成熟度和研究花粉发育相关基因功能的最直接的方法之一，不仅可以根据花粉萌发率和花粉管生长速率判断目标基因是否参与调节该生理过程；还可以根据花粉管表型变化研究目标基因发挥作用的分子机制。

除拟南芥自身基因的功能研究外，许多尚未建立遗传转化体系的草本或木本植物仍然需要利用模式植物拟南芥来开展目标基因功能验证的工作。此外，多数木本植物具有较长的童期，研究其花器官发育以及雌、雄配子体发育相关基因的功能，短期内难以在木本植物自身实现，仍然需要利用拟南芥对基因功能进行验证。例如，在柿子(diospyroslotus)中克隆的性别决定基因megi，拟南芥过量表达megi基因出现雄蕊缺损、变短、花粉萌发率降低等表型，表明megi基因能够抑制雄蕊发育。在猕猴桃、杨树等雌雄异株植物性别决定基因功能的研究报道中，拟南芥也都有相类似的应用。

现有的拟南芥花粉离体萌发方法存在花粉用量大、花粉萌发率低、重复性差等缺点，因此亟需建立一种高效、稳定的拟南芥花粉离体萌发方法，为花粉萌发活力及育性的快速鉴定提供一种有效途径，为研究花粉组织特异的基因功能提供一种有效手段，也为其它非模式植物花粉离体萌发的研究提供参考。一种拟南芥花粉离体萌发培养基和培养方法(cn103409362b)公开了一种拟南芥花粉离体萌发液体培养基，该培养基大大提高了拟南芥花粉离体萌发率和增加了花粉管长度，但由于其使用液体培养基，一方面不利于花粉离体萌发培养后续的显微观察、拍照和统计；另一方面其在收集花粉的过程中，需要离心，而离心过程可能会对花粉造成损伤，操作繁琐。

技术实现要素：

针对现有技术存在的上述缺陷，本发明所要解决的第一技术问题在于提供一种测定拟南芥离体花粉萌发率的方法，具有操作便捷，花粉用量更少，对花粉损伤更小，花粉萌发效率高，重复性好等优势。本发明所要解决的另一技术问题是提供一种采集拟南芥高萌发率花粉的方法。本发明还要解决一技术问题是提供一种高萌发率的拟南芥花粉培养方法。

为了解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案如下：

一种测定拟南芥离体花粉萌发率的方法，包括以下步骤：

1)取拟南芥种子，消毒，在1/2ms培养基上播种，培养至萌发第10d，将萌发的幼苗移栽到营养土中生长，直至拟南芥开花；

2)当天采集主茎上完全盛开的第14阶段的花朵，用镊子夹着花柄将雄蕊上的花粉涂布在固体培养基中央，然后将花倒置在花粉涂布的边缘位置，控温保湿，将培养皿倒置在培养箱中暗培养。

步骤1)中，将拟南芥种子分别经4％naclo消毒10min，70％酒精消毒30s，无菌水清洗5次。

步骤1)中，在1/2ms培养基中含有3wt.％蔗糖和0.8wt.％琼脂组分。

步骤1)中，先4℃低温暗培养3d，然后转移至16h光照/8h黑暗的22℃组培室培养一周，进行萌发培养。

步骤1)中，营养土由体积比为3∶3∶3∶1的营养土、有机质、蛭石和珍珠岩组成。

步骤2)中，采集的花朵，为拟南芥抽薹长至10-12cm高时的花朵。待拟南芥抽薹开花长至10-12cm高时，是进行花粉离体萌发的最佳时期，过早或者过晚都会影响花粉萌发率。

步骤2)中，固体培养基的配制：取250ml水，依次加入25g蔗糖、1％的硼酸2.5ml、50mm的cacl25ml、50mm的ca(no3)25ml、50mm的kcl5ml、1％的水解酪蛋白7.5ml、1％的柠檬酸铁铵2.5ml、50mg/ml的肌醇0.5ml、50mm亚精胺0.5ml，用1m的koh调节ph值至7.5，将总体积定容至250ml，加入琼脂糖3g，微波炉中火加热熔解后倒入直径9cm的圆形塑料培养皿中，每皿25ml。

步骤2)中，在温度26℃，湿度85％的培养箱中，将培养皿倒置暗培养6h。

步骤2)中，固体培养基在收集拟南芥花粉前配制，当天10点采花。

一种采集拟南芥高萌发率花粉的方法，在拟南芥抽薹长至10-12cm，采集当天主茎上开至第14阶段的花朵的花粉。

一种高萌发率的拟南芥花粉培养方法：将拟南芥种子分别经4％naclo消毒10min，70％酒精消毒30s，无菌水清洗5次，播种含3％蔗糖和0.8％琼脂的1/2ms培养基，4℃低温暗培养3d，转移至16h光照/8h黑暗的22℃组培室培养一周，然后将萌发的幼苗移栽到营养土中，培养条件为温度22℃，16h光照/8h黑暗，直至拟南芥抽薹长至10-12cm高，采集当天主茎上开至第14阶段的花朵的花粉。

有益效果：相比于现有技术，本发明的优点为：

1)本发明提供的测定拟南芥离体花粉萌发率的方法，操作便捷，花粉用量更少，对花粉损伤更小，花粉萌发效率高，重复性好，为花粉萌发活力及育性的快速鉴定提供一种有效途径，为研究花粉组织特异的基因功能提供一种有效手段，也为其它非模式植物花粉离体萌发的研究提供参考。

2)本发明所使用的花粉萌发固体培养基，相比于液体培养基，有利于花粉离体萌发培养后续的显微观察、拍照和统计。

附图说明

图1为拟南芥花粉收集与涂布图；

图2为本发明方法培养的花粉萌发照片；

图3为两种培养基对拟南芥花粉萌发率的影响图；

图4为不同采样时期对拟南芥花粉萌发率的影响图；

图5为不同时间本发明方法培养的花粉萌发率统计图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进一步进行描述。以下实施例中如无特殊说明，所用的技术手段均为本领域技术人员所熟知的常规手段。以下实施例中所用的水均为灭过菌的所用到的花粉萌发储备液的配制方法如下：

1％硼酸：称取0.5g的h3bo3，溶于水中，定容至50ml，4℃保存。

50mmcacl2：称取0.277475g的cacl2，溶于水中，定容至50ml，4℃保存。

50mmca(no3)2：称取0.410225g的ca(no3)2，溶于水中，定容至50ml，4℃保存。

50mmkcl：称取0.186375g的kcl，溶于水中，定容至50ml，4℃保存。

1％水解酪蛋白：称取0.5g的水解酪蛋白，溶于水中，定容至50ml，4℃保存。

1％柠檬酸铁铵：称取0.5g的柠檬酸铁铵，溶于水中，定容至50ml，4℃避光保存。

50mg/ml肌醇：称取2.5g的肌醇，溶于水中，定容至50ml，4℃保存。

50mm亚精胺：吸50μl的亚精胺，加4.95ml水，-20℃保存。

1mkoh：称取2.81g的koh，溶于水中，定容至50ml，常温保存。

实施例1

以拟南芥(columbia-0，简写col-0)和过表达杨树ptferr基因(female-specificallyexpressedresponseregulator)的三个拟南芥纯合株系(l365、l454和l498)为供试材料，col-0作为野生型对照，探索ptferr基因过量表达是否影响拟南芥花粉的发育，包括如下步骤：

1)拟南芥播种与移苗培育：将0.1gcol-0、l365、l454和l498的种子分别经4％naclo消毒10min，70％酒精消毒30s，无菌水清洗5次，播种1/2ms培养基(含3％蔗糖和0.8％琼脂)，4℃低温暗培养3d，转移至16h光照/8h黑暗的22℃组培室培养一周，然后将萌发的col-0、l365、l454和l498幼苗移栽到营养土中(营养土∶有机质∶蛭石∶珍珠岩＝3∶3∶3∶1)，对照和三个转基因株系分别移栽40株。培养条件为温度22℃，16h光照/8h黑暗，直至拟南芥抽薹长至10-12cm高。

2)培养基配制：采集花粉当天，取250ml水，依次加入25g蔗糖、1％的硼酸2.5ml、50mm的cacl25ml、50mm的ca(no3)25ml、50mm的kcl5ml、1％的水解酪蛋白7.5ml、1％的柠檬酸铁铵2.5ml、50mg/ml的肌醇0.5ml、50mm亚精胺0.5ml，用1m的koh调节ph值至7.5，将总体积定容至250ml，加入琼脂糖3g，微波炉中火加热熔解后倒入直径9cm的圆形塑料培养皿中，每皿25ml，待培养基完全凝固后，用黑色记号笔在培养皿背面画1cm×1cm方格。

本实施例的培养基中增加了三种有机成分：水解酪蛋白、柠檬酸铁铵和亚精胺。花粉管的萌发和伸长需要合成大量蛋白，水解酪蛋白可以为花粉在离体条件下的蛋白质合成提供氨基酸；亚精胺属于多胺类化合物，是生物体内代谢过程中产生的活性低分子量脂肪族含氮碱，是植物激素作用的媒介，在一定浓度范围内有利于花粉萌发和花粉管生长。

3)花粉收集与涂布：上午10点分别采集col-0、l365、l454和l498主茎上当天完全盛开的花朵，用镊子夹着花柄将雄蕊上的花粉涂布在方格中央，然后将花倒置在花粉涂布的边缘位置，每皿30朵花(图1)，重复3次。

4)花粉离体培养：在温度26℃，湿度85％的培养箱中，将培养皿倒置暗培养6h。

5)显微观察：移除培养基倒置的花朵，将1cmx1cm的小方格切下来，置于载玻片上，在axioimager2(zeiss)型光学显微镜下观察，花选取至少有200粒花粉的视野拍照记录(图2)，每个株系拍90张。

6)花粉萌发率统计：利用imagej软件的cellcounter功能统计col-0、l365、l454和l498花粉萌发率。

本实施例中，共选取了1个野生型株系(col-0)及3个拟南芥转基因株系(l365、l454和l498)进行花粉离体萌发，通过统计花粉萌发率和测量花粉管长度，结果表明：杨树ptferr基因过量表达对拟南芥花粉发育没有影响(图2)。

实施例2

以拟南芥(columbia-0，简写col-0)和过表达杨树ptferr基因(female-specificallyexpressedresponseregulator)的三个拟南芥纯合株系(l365、l454和l498)为供试材料，对比不同培养基对拟南芥花粉萌发率的影响，实施步骤与实施例1基本相同，不同之处在于将收集到的花粉分别涂布在培养基a和培养基b。

培养基a为本发明的花粉萌发固体培养基：质量体积浓度为10％蔗糖，质量体积浓度为0.01％硼酸，1mmcacl2，1mmca(no3)2，1mmkcl，质量体积浓度为0.03％水解酪蛋白，质量体积浓度为0.01％柠檬酸铁铵，质量体积浓度为0.01％肌醇，0.1mm亚精胺，1mkoh调节ph值7.5，然后加入质量体积浓度为1.2％琼脂糖。

培养基b参考fanetal.，2001(doi：10.1093/jexbot/52.361.1603)：5mmmes，1mmkcl，10mmcacl2，0.8mmmgso4，1.5mm硼酸，16.6％蔗糖，3.65％山梨醇，10μg/ml肌醇，1mkoh调节ph值7.5，然后加入质量体积浓度为1.2％琼脂糖。

本实施例中，共选取了1个野生型株系(col-0)及3个拟南芥转基因株系(l365、l454和l498)进行花粉离体萌发，分别统计col-0、l365、l454和l498的花粉萌发率，结果表明：不同来源的拟南芥花粉在两种培养基上均可萌发，但在培养基a上的花粉萌发率显著高于培养基b(图3)。

实施例3

以拟南芥(columbia-0，简写col-0)为供试材料，对比不同采样时期对拟南芥花粉萌发率影响，实施步骤与实施例1基本相同，不同之处在于分别收集不同时期的拟南芥花粉涂布在本发明的花粉萌发固体培养基。

时期一：收集拟南芥植株抽薹生长至10-12cm高时的完全盛开花(即bowmanetal.，1991定义的第14阶段的花)。

时期二：收集拟南芥株抽薹生长至30-40cm高时完全盛开花(即bowmanetal.，1991定义的第14阶段的花)。

本实施例中，选取了不同时期的野生型(col-0)进行花粉离体萌发，通过统计花粉萌发率，结果表明：10-12cm高的拟南芥花粉萌发率显著高于30-40cm高的拟南芥花粉(图4)。拟南芥抽薹开花长至10-12cm高时，是进行花粉离体萌发实验的最佳时期，生长后期的拟南芥花粉萌发率较低，不适于进行花粉离体萌发实验。

实施例4

以拟南芥(columbia-0，简写col-0)和过表达杨树ptferr基因(female-specificallyexpressedresponseregulator)的三个拟南芥纯合株系(l365、la54和la98)为供试材料，分别在2020年1月、9月和10月进行种子萌发和育苗，实施步骤与实施例1基本相同。通过统计花粉萌发率，对比不同月份开展的花粉离体萌发实验，结果表明：同一材料在不同批次实验中，花粉萌发率稳定(图5)，实验重复性良好。