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用于增加谷物产量的基因及其用途的制作方法

来源：花匠小妙招时间：2025-09-27 03:43

专利名称：用于增加谷物产量的基因及其用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及分离和鉴定调节植物着粒数(包括颖花、果实和种子)增减的基因，以及利用这些基因增加植物着粒数(包括颖花、果实和种子)的育种方法。
背景技术：
当世界人口持续显示迅速增长，由于环境污染、全球变热和沙漠化可耕地迅速减少，而在发展中国家中持续着长期的粮食短缺。此外，目前1.0％的谷物生产增长率低于每年1.4％的全球人口增长率；而且，在2025年，当预测世界人口超过80亿时，谷物需求将增加50％，进一步加速了粮食短缺。为了打破这个严重的情况，不仅政治和经济的措施是必需的，而且增加谷物生产数量的科学的谷物育种策略也是必需的。这个严重的状况不再能通过传统的育种，单独利用异花受精和选择技术加以避免，而关于针对增加产率的谷物植株类型以及特异和有效的谷物育种的研究才是必需的。
当在60年代提出关于世界粮食危机的忧虑时，在国际水稻研究机构(菲律宾)培养出了称为奇迹水稻的矮茎高产水稻，而在国际玉米和小麦改良中心(墨西哥)栽培出了矮茎高产的小麦。由于这两个品种的快速扩展避免了世界粮食危机。这就是所谓的″绿色革命″。两个品种都显示为传统品种的两倍产量，而这个高产特性是由称为半矮化的矮茎植株类型所引起的。由于当为了得到高产量时必须应用氮肥，这同时诱导了植株的伸长，并且由于风雨，伸长谷物的倒伏显著降低了产量。另一方面，即使应用肥料，矮茎品种容许增加产量而没有肉质部分的生长。也就是说，两个矮茎品种都通过获得抗倒伏性而促进了显著增加产量的″绿色革命″。目前，半矮化的谷物极大地促进了产量的增加，但是因为许多谷物品种已经利用了半矮化基因，就不能预期进一步在产量中再利用这个技术，而必须开发利用新技术的谷物生产方法。
水稻是50％的世界人口所利用的食品。特别地，对于生活在亚洲的人口，其栽培特性与高度湿润的季风气候相匹配，其不仅早已作为主食成为能源，而且也已经很好地进行存活和栽培。因此，已经在许多地方进行育种，并且已经将其改良而具有便于人类使用的特性。此外，利用最近确定的水稻基因组核苷酸序列，使用分子遗传学的工具，可预期开发利用基因组遗传学的新育种技术。
迄今为止，已经通过多种努力来增加谷物(植物)的产量；然而，对于分离和鉴定涉及直接对增产负责的花和种子(颖花)的数目增减的基因尚无报道。除传统的半矮化谷物外，如果开发了调节花和种子(颖花)的数目增减的技术，就可预期进一步增加谷物的产量。
发明公开本发明已经鉴于上述情况而实现。本发明的目的是分离和鉴定涉及植物着粒数(包括颖花、果实和种子)增减的基因，并且提供利用这些基因增加植物着粒数(包括颖花、果实和种子)的育种方法。
为了增加谷物(植物)产量，本发明人使用水稻植株作为单子叶植物模型，搜索直接对增产负责的基因，更具体地说搜索涉及花和种子(颖花)的数目增减的基因。通过多于一个基因的相互作用将花和种子(颖花)的数目控制作为数量性状(QTL)。因此，为了产生用于QTL分析的杂种群体，选择杂种的亲本品种。2个品种显示着粒数(particle-bearing number)的明显差异，选择出粳稻″Koshihikari″和籼稻″Habataki″(

图1)。将通过使2个品种杂交产生的F1个体利用Koshihikari作为重复亲本进行回交并且进行自交。在名古屋大学农场栽培和发展所得到的74个品种的BC2F1、BC2F2、和BC3F2群体。利用74个BC2F2植株进行关于着粒数的QTL分析，检测大量的增加着粒数的QTL(图2)。特别地，成功地发现位于1号染色体短臂中大约28cM的Habataki的QTL(YQ1；Yielding QTL 1)与Koshihikari的QTL相比，极有效的增加谷粒(或种子)的数目。为了检验YQ1的存在，使用重复回交和MAS产生YQ1半等基因系，研究Nil-YQ1和Koshihikari(对照)的最大着粒数。结果是，证实QTL(YQ1)的存在，并且发现用Habataki的位点取代1号染色体短臂中大约28cM位点的品种其着粒数平均增加了50。
然后，从每一74个BC2F1个体中，利用CTAB法提取DNAs，利用完全覆盖所有染色体的93个分子标记物确定每一个体的基因型。在每个品种的10个个体发展出其自交后代BC2F2，并且从中随机选择每个品种的一个个体。在从每一选择的个体取样6个圆锥花序后，对于每个圆锥花序研究着粒数。在每一品种的6个圆锥花序中，选择具有最大着粒数的圆锥花序，并将这个数目用作最大着粒数。然后利用Qgene软件进行QTL分析。
利用分子标记物，使用BC3F2群体研究表型和基因型(F2和F3)，并且再进行连锁分析。结果表明YQ1位于分子标记物6A和8A之间(图3)。利用YQ的分离群体(12500个个体)进行高分辨率连锁分析的结果是，表明YQ1位点处于标记物4A9和20之间的大约8Kb的区域(图4)。当在这个区域中进行基因预测时，预测到单个基因，并且同源性搜索的结果是发现与CKX(细胞分裂素氧化酶)高度同源的基因(图4)。当对于Habataki和Koshihikari确定这个CKX基因的核苷酸序列时，发现了核苷酸中的差异，Habataki的CKX似乎已经丢失其功能(图5)。
此外，当搜索水稻基因组序列来分析水稻中的CKX基因时，在水稻基因组中发现存在11个CKX基因。当对于这些基因以及拟南芥中的CKX基因构建系统演化树时，发现拟南芥的AtCKX2、3、和4，以及5个水稻CKX基因(位于Chr.1 25cM P695A4的CKX、位于Chr.127P419B01的CKX(本基因)、位于Chr.679cM OsJ0006A22-GS的CKX基因、和2个位于32cM的CKX基因)是极为紧密相关的(图6)。当研究这些基因的同源性时，发现它们在氨基酸水平是高度同源的(图7至9)。此外，当证实了水稻中所有CKX基因的基因座位置时，发现其中一些位于YQ区域上(图10)。
更具体地说，本发明人成功地分离了涉及植物着粒数增减的新基因，并因此完成了本发明。
本发明涉及分离和鉴定调节植物着粒数(包括颖花、果实和种子)增减的基因，以及利用这些基因增加植物着粒数(包括颖花、果实和种子)的育种方法，并且本发明提供如下所述的[1]至[19]。
一种编码其功能缺失导致植物着粒数增加的植物来源蛋白质的DNA，其中该DNA是(a)至(d)中的任意一项(a)编码包括SEQ ID NO3的氨基酸序列的蛋白质的DNA；(b)包括包含SEQ ID NO1或2的核苷酸序列的编码区的DNA；
(c)编码包括SEQ ID NO3的氨基酸序列的蛋白质的DNA，其中已经取代、缺失、添加、和/或插入了一个或多个氨基酸；以及(d)在严谨条件下与包括SEQ ID NO1或2的核苷酸序列的DNA杂交的DNA。
权利要求[1]的DNA，其中该DNA来源于稻(rice)。
编码与权利要求[1]或[2]的DNA的转录本互补的RNA的DNA。
编码具有特异切割权利要求[1]或[2]的DNA转录本的核糖酶活性的RNA的DNA。
编码通过在植物细胞中表达时的共抑制效果而抑制权利要求[1]或[2]的DNA表达的RNA的DNA。
包括权利要求[1]至[5]中任意一项DNA的载体。
用权利要求[6]的载体转染的宿主细胞。
用权利要求[6]的载体转染的植物细胞。
包括权利要求[8]的植物细胞的转化植物。
权利要求[9]的转化植物的后代或克隆的转化植物。
权利要求[9]或[10]的转化植物的再生材料。
用于生产转化植物的方法，其中该方法包括将权利要求[1]至[5]中任意一项DNA导入到植物细胞中，以及从所述的植物细胞再生植物体的步骤。
由权利要求[1]或[2]的DNA编码的蛋白质。
用于生产权利要求[13]的蛋白质的方法，其中该方法包括培养权利要求[7]的宿主细胞，以及从所述的细胞或其培养物上清液收集重组蛋白质的步骤。
结合权利要求[13]的蛋白质的抗体。
包括与SEQ ID NO1或2的核苷酸序列、或其互补序列互补的至少15个连续核苷酸的多核苷酸。
用于增加植物着粒数的方法，其中该方法包括在植物体的细胞中表达权利要求[3]至[5]中任意一项的DNA的步骤。
用于改变植物着粒数的试剂，其中该试剂包括权利要求[1]至[5]的任意一项DNA或权利要求[6]的载体作为活性成分。
一种用于确定植物着粒数的方法，其中该方法包括下列步骤
(a)从待测植物体或其再生培养基制备DNA样品；(b)扩增所述DNA样品的相应于权利要求1的DNA的区域；以及(c)确定所扩增的DNA区域的核苷酸序列；其中当该核苷酸序列编码其功能缺失导致植物着粒数增加的蛋白质时，确定该植物是具有小的着粒数的品种，而当没有编码所述的蛋白质时，确定该植物是具有大的着粒数的品种。
本发明提供编码水稻来源的CKX蛋白质的DNAs。″Koshihikari″中DNA的基因组序列如SEQ ID NO1所示，其cDNA序列如SEQ ID NO2所示，而由此DNA编码的蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO3所示。″Habataki″中DNA的基因组序列如SEQ ID NO4所示，其cDNA序列如SEQID NO5所示，而由此DNA编码的蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO6所示。
通过本发明分离的CKX基因位于利用″Habataki″和″Koshihikari″的杂交后代检测到的一个数量性状位点(QTL)，并且发现其位于1号染色体上。当在Habataki和Koshihikari中确定这个CKX基因的核苷酸序列时，发现了核苷酸中的差异，发现与例如Koshihikari的其它品种相比具有较大着粒数的Habataki的CKX蛋白质已经丢失其功能。
细胞分裂素(对于一组具有与激动素(kinetin)相似的生物活性，并且在腺嘌呤的第6位具有取代基的化合物的通称)，是植物激素，涉及促进细胞分裂、花芽形成、侧芽形成、抑制老化、气孔运动、根伸展等。特别地，花芽形成和侧芽形成的促进可能与令人感兴趣的性状(颖花数目的增加)紧密相关。利用甲羟戊酸作为底物，借助4个催化反应合成细胞分裂素，但是通过细胞分裂素氧化酶，它在腺嘌呤的第6位发生裂解而失活(例如，玉米素降解为腺嘌呤和甲基丁醛)。更具体地说，当CKX(细胞分裂素氧化酶)基因的功能丢失，细胞分裂素不能降解，结果是细胞分裂素积聚。因为细胞分裂素的累积诱导花芽形成，这可导致着粒数(颖花的数目)增加，这与CKX基因的功能和表型很好的相符。这表明CKX基因功能的缺失增加水稻(rice)植株的着粒数(颖花的数目)，结果是产量增加。迄今为止，尚未鉴定或分离出认为与着粒数(颖花数)增加相关的基因。通过进行复杂的步骤，本发明人最终阐明了其存在的区域并且首次成功地分离了作为单个基因的所述基因。
目前，在日本水稻品种的改良中着粒数的增加是重要的育种目标。增加着粒数直接导致增加谷物产量的性状，并且因为这种性状在农业方面是非常重要的，预期其可用于通过使用CKX基因进行育种。
因为CKX基因功能的缺失增加植物的着粒数，因此利用反义方法、核糖酶方法等调节该DNA的表达可导致增加谷物的产量。例如，通过将CKX基因以反义方向导入CKX基因有功能的品种，例如″Koshihikari″，可增加着粒数。此外，可利用分子标记物通过导入失活形式的CKX基因而增加着粒数。导入的方法可以是转化或杂交。与通过杂交的基因转移相比，转化所需要的时间是很短的，并且这容许增加着粒数而不伴随其它性状的变化。利用本发明分离的并且涉及着粒数增减的CKX基因，容许水稻植物的着粒数容易地变化，并且可促进栽培增加着粒数的水稻品种。因为在谷物中基因组同线性(遗传同源性)是高度保守的，可以预期将水稻CKX基因应用在繁殖谷物，例如小麦、大麦和玉米中。此外，因为CKX基因不限于谷物，并且广泛分布于植物中，CKX基因功能的缺失可能增加所有植物的花和种子(颖花)的数目，而导致产量的增加。
本发明的编码CKX蛋白质的DNA包括基因组DNA、cDNA、和化学合成的DNA。可根据本领域技术人员公知的常规方法制备基因组DNA和cDNA。更具体地说，例如可如下制备基因组DNA(1)从具有CKX基因的水稻品种(例如Koshihikari)提取基因组DNA；(2)构建基因组文库(利用载体，例如质粒、噬菌体、柯斯质粒、BAC和PAC)；(3)扩展文库；以及(4)利用根据本发明编码蛋白质的DNA(例如SEQ ID NO1或2)制备的探针进行集落杂交或噬菌斑杂交。备选地，可通过PCR，利用特异于本发明编码蛋白质的DNA(例如SEQ ID NO1或2)的引物来制备基因组DNA。另一方面，例如可如下制备cDNA(1)根据从具有CKX基因的水稻品种(例如Koshihikari)提取的mRNAs合成cDNAs；(2)通过将合成的cDNA插入到载体，例如λZAP中来制备cDNA文库；(3)扩展cDNA文库；以及(4)如上所述进行集落杂交或噬菌斑杂交。备选地，也可通过PCR制备cDNA。
本发明包括编码与SEQ ID NO3的CKX蛋白质功能等效的蛋白质的DNAs(Koshihikari)。在此，术语″与CKX蛋白质功能等效″表明目的蛋白质的功能缺失导致着粒数的增加。这种DNA优选来源于单子叶植物，更优选地来源于禾本科，以及最优选地来源于水稻。
这种DNAs的实例包括编码包括SEQ ID NO3的氨基酸序列的突变体、衍生物、等位基因、变体和同系物的DNAs，其中取代、缺失、添加和/或插入一个或多个氨基酸。
本领域技术人员公知的、用于制备编码包括改变氨基酸的蛋白质的DNA的方法实例包括定点诱变(Kramer，W.和Fritz，H.-J.，(1987)″Oligonucleotide-directed construction of mutagenesis via gapped duplex DNA.″Methods in Enzymology，154350-367)。也可在自然界中由于核苷酸序列的突变而改变蛋白质的氨基酸序列。其中取代、缺失和/或添加了一个或多个氨基酸的、编码具有天然CKX蛋白质的氨基酸序列的蛋白质的DNA也包括在本发明的DNA内，只要其编码与天然CKX蛋白质(SEQ ID NO3)功能等效的蛋白质。另外，不在蛋白质中产生氨基酸序列变化的核苷酸序列突变体(简并突变体)也包括在本发明的DNA内。
例如可通过本领域技术人员已知的方法产生编码与SEQ ID NO3中所描述的CKX蛋白质功能等效的蛋白质的DNA，包括利用杂交技术的方法(Southern，E.M.Journal of Molecular Biology，Vol.98，503，1975.)；和聚合酶链式反应(PCR)技术(Saiki，R.K.等人Science，vol.230，1350-1354，1985；Saiki，R.K.等人Science，vol.239，487-491，1988)。也就是说，对于本领域的技术人员来说，利用CKX基因的核苷酸序列(SEQ ID NO2)或其部分作为探针、和特异地与CKX基因核苷酸序列(SEQ ID NO2)杂交的寡核苷酸作为引物而分离与来自水稻和其他植物的CKX基因具有高同源性的DNA是常规的。这种通过杂交技术或PCR技术可获得的、编码与CKX蛋白质功能等效的蛋白质的DNA包括在本发明的DNA内。
分离这种DNAs的杂交反应优选在严谨条件下进行。本发明的严谨杂交条件包括例如6M尿素，0.4％SDS，和0.5×SSC的条件；以及产生与该条件相似严谨度的条件。当在较高严谨的条件，例如6M尿素，0.4％SDS和0.1×SSC下进行杂交时，预期DNAs具有较高的同源性。预期在这种条件下分离的那些DNAs编码与CKX蛋白质(SEQ ID NO3或6)具有高氨基酸水平同源性的蛋白质。在此，高同源性是指通过全部的氨基酸序列同一性为至少50％以上，更优选为70％以上，以及更加优选为90％以上(例如95％、96％、97％、98％、99％以上)。可按照Karlin和Altschul的算法BLAST(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 872264-2268，1990；Proc.Natl.Acad.Sci.USA，905873，1993)确定一个氨基酸序列或核苷酸序列与另一个的同源性程度。根据BLAST算法(Altschul SF，等人J.Mol.Biol.215403，1990)开发例如BLASTN和BLASTX的程序。为了根据BLASTN分析核苷酸序列，设置参数，例如积分＝100和字长＝12。另一方面，经BLASTX用于氨基酸序列分析的参数包括例如，积分＝50和字长＝3。当利用BLAST和Gapped BLAST程序时使用每个程序的默认参数。用于这种分析的特定技术是本领域已知的。
可如下对特定的DNA是否编码涉及植物着粒数增减的蛋白质进行评估。大多数常规方法包括缺失DNA的功能，然后进行栽培，并且研究着粒数。更具体地说，该方法包括在保持DNA功能的条件下和在缺失DNA功能的条件下进行载培，并且比较所得到的着粒数。如果着粒数没有变化或几乎是相同的，则判断DNA不涉及着粒数的增减。当DNA涉及着粒数的增减时，着粒数进一步得到增加，而这个差异被认为是着粒数增减的程度。
本发明的DNA可用于例如制备重组蛋白质，和产生具有改变着粒数的植物转化体。通常通过将本发明的编码蛋白质的DNA插入到适当的表达载体中，将载体导入到适当的细胞中，载培转化细胞，容许细胞表达重组蛋白质以及纯化表达的蛋白质来制备重组蛋白质。重组蛋白质可表达为与其它蛋白质一起的融合蛋白以便于容易地纯化，例如作为大肠杆菌中与麦芽糖结合蛋白一起的融合蛋白(New England Biolabs，美国，载体pMAL系列)，作为与谷胱甘肽-S-转移酶(GST)一起的融合蛋白(Amersham PharmaciaBiotech，载体pGEX系列)，或带有组氨酸标记(Novagen，pET系列)。不限制宿主细胞，只要该细胞适合于表达重组蛋白。除上述的大肠杆菌外有可能利用酵母或多种动物、植物、或昆虫细胞。可通过本领域技术人员公知的多种方法将载体导入宿主细胞。例如，可使用利用钙离子的转化方法(Mandel，M.和Higa，A.(1970)Journal of Molecular Biology，53，158-162，Hanahan，D.(1983)Journal of Molecular Biology，166，557-580)将载体导入到大肠杆菌中。可从宿主细胞或其培养物上清液通过已知的方法纯化和回收在宿主细胞中表达的重组蛋白。当重组蛋白质表达为与麦芽糖结合蛋白或其它伴侣一起的融合蛋白时，可通过亲和色谱法容易地纯化重组蛋白质。可从已经通过将本发明的DNA如下所述导入到植物中而产生的转化植物来制备本发明的蛋白质。因此，本发明的转化植物不仅包括携带已经如下所述被导入以改变着粒数的本发明DNA的植物，而且包括携带已经被导入以制备本发明蛋白质的本发明DNA的植物。
所得到的蛋白质可用于制备结合该蛋白质的抗体。例如，可通过用本发明的纯化蛋白质或其部分免疫免疫动物，例如兔，在某一段时间后收集血液并且移出凝块来制备多克隆抗体。可通过将骨髓瘤细胞与用上述蛋白质或其部分免疫的动物的抗体-形成细胞融合，分离表达所需要抗体的单克隆细胞(杂交瘤)，并且从该细胞回收抗体来制备单克隆抗体。可利用所得到的抗体来纯化或检测本发明的蛋白质。因此、本发明包括结合本发明蛋白质的抗体。利用这些抗体能够鉴别涉及植物体着粒数增减的蛋白质的表达位点，或确定植物品种是否表达涉及着粒数增减的蛋白质。
例如，因为特异识别具有小的着粒数的″Koshihikari″的羧基末端氨基酸序列的抗体不结合在例如具有大的着粒数的″Habataki″品种中表达的蛋白质，因此它可用于鉴别涉及着粒数增减的蛋白质是否在特定的植物品种中表达。
当生产已经利用本发明的DNA增加着粒数的转化植物时，将用于抑制本发明编码蛋白质的DNA表达的DNA插入到适当的载体中，然后将该载体导入植物细胞。然后使通过这些步骤获得的转化植物细胞再生。接收载体的植物细胞优选是显示正常表达本发明DNA的植物细胞。″抑制本发明编码蛋白质的DNA的表达″包括抑制基因的转录和抑制翻译成为蛋白质。此外，它不仅包括实现终止DNA表达，而且包括降低表达。
例如可利用编码与本发明编码蛋白质的DNA转录本互补的RNA的DNA抑制植物中特定内源基因的表达。
″编码与本发明编码蛋白质的DNA转录本互补的RNA的DNA″的一个实施方案是编码与本发明编码蛋白质的DNA的转录本互补的反义RNA的DNA。Ecker等人最先证明了通过电穿孔在植物细胞中利用瞬时基因表达方法导入反义RNA的反义效果(J.R.Ecker和R.W.Davis(1986)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 835372)。此后，据报道在烟草和矮牵牛中通过表达反义RNAs降低了靶基因表达(A.R.van der Krol等人(1988)Nature 333866)。现在已经确定反义技术为抑制植物中靶基因表达的方式。
多个因素导致反义核酸抑制靶基因表达。这些因素包括通过形成三倍体链抑制转录起始；通过在RNA聚合酶已经形成局部开环结构的位点形成杂合物抑制转录；通过与正在合成的RNA形成杂合物而抑制转录；通过在内含子和外显子之间的接合点形成杂合物而抑制拼接；通过在剪接体形成位点形成杂合物而抑制拼接；通过与mRNA形成杂合物而抑制mRNA从细胞核移位到细胞质；通过在加帽位点或poly A添加位点形成杂合物而抑制拼接；通过在翻译起始因子的结合位点形成杂合物而抑制翻译起始；通过在核糖体结合起始密码子附近的位点形成杂合物而抑制翻译；通过在翻译区或在mRNA的多核糖体结合位点形成杂合物而抑制肽链延伸；以及通过在核酸和蛋白质之间相互作用的位点形成杂合物而抑制基因表达。这些因素通过抑制转录、拼接或翻译的过程而抑制靶基因表达(Hirashima和Inoue，″Shin Seikagaku Jikken Koza(New Biochemistry Experimentation Lectures)2，Kakusan(Nucleic Acids)IV，Idenshi No Fukusei To Hatsugen(Replication andExpression of Genes)，″Nihon Seikagakukai Hen(The Japanese BiochemicalSociety)，Tokyo Kagaku Dozin，pp.319-347，(1993))。
本发明的反义序列可通过任何上述的机制抑制靶基因表达。在一个实施方案中，如果设计反义序列是与基因mRNA 5′末端附近的非翻译区互补的，则它将有效地抑制基因的翻译。也可利用与编码区或3′侧的非翻译区互补的序列。因此，用于本发明的反义DNA包括具有针对基因的非翻译区和翻译区的反义序列的DNA。所使用的反义DNA连接适当启动子的下游，并且优选地包含转录终止信号的序列连接到3′侧上。可通过已知的方法将如此制备的DNA转染到所需要的植物中。反义DNA的序列优选是与待转化的植物内源基因或其部分互补的序列，但不必是完全互补的，只要它有效地抑制基因表达。转录的RNA优选与靶基因的转录本是至少90％，以及最优选至少95％互补的。为了借助反义序列有效抑制靶基因的表达，反义DNA应为至少15个核苷酸长，更优选至少100个核苷酸长，以及更优选至少500个核苷酸长。所使用的反义DNA一般短于5kb，以及优选短于2.5kb。
也可使用编码核糖酶的DNA抑制内源基因的表达。核糖酶是具有催化活性的RNA分子。存在许多具有多种活性的已知核糖酶。关于核糖酶作为RNA切割酶的研究使得能够设计核糖酶在特异位点切割RNA。虽然I组内含子型的一些核糖酶或包含在RNaseP中的M1RNA由400个以上的核苷酸组成，其它属于锤型或发夹型的核糖酶具有大约40个核苷酸的活性结构域(Makoto Koizumi和Eiko Ohtsuka(1990)Tanpakushitsu Kakusan Kohso(Protein，Nucleic acid and Enzyme)352191)。
锤型核糖酶的自裂解结构域在序列G13U14C15的C15的3′侧进行切割。认为在U14和第9位A之间形成的核苷酸对对于核糖酶活性是重要的。此外，已经表明当第15位的核苷酸是A或U而不是C时也发生裂解(M.Koizumi等人(1988)FEBS Lett.228225)。如果设计核糖酶的底物结合位点与邻近于靶位点的RNA序列是互补的，就可产生限制性酶样的RNA切割核糖酶，其在靶RNA内识别序列UC、UU、或UA(M.Koizumi等人(1988)FEBS Lett.239285；Makoto Koizumi和Eiko Ohtsuka(1990)Tanpakushitsu KakusanKohso(Protein，Nucleic acid and Enzyme)，352191；M.Koizumi等人(1989)Nucleic Acids Res.177059)。例如，在CKX基因(SEQ ID NO2)的编码区中，存在许多可用作核糖酶靶的位点。发夹型核糖酶也对本发明有用。例如可在烟草环斑病毒的卫星RNA的负链中发现发夹型核糖酶(J.M.Buzayan，Nature 323349(1986))。这个核糖酶也已经显示靶特异地切割RNA(Y.Kikuchi和N.Sasaki(1992)Nucleic Acids Res.196751；Yo Kikuchi(1992)Kagaku To Seibutsu(Chemistry and Biology)30112)。
设计成能切割靶的核糖酶是与启动子，例如花椰菜花叶病毒35S启动子以及与转录终止序列融合的，以便它能够在植物细胞中转录。然而如果将附加的序列添加到转录RNA的5′末端或3′末端，可能丢失核糖酶活性。在这种情况下，可安置以顺式在核糖酶部分的5′或3′侧上进行修整的附加修整核糖酶，以便准确地从包含核糖酶的转录RNA切下核糖酶部分(K.Taira等人(1990)Protein Eng.3733；A.M.Dzaianott和J.J.Bujarski(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 864823C.A.Grosshands和R.T.Cech(1991)NucleicAcids Res.193875；K.Taira等人(1991)Nucleic Acid Res.195125)。可通过串联排列这些结构单位而切割靶基因内的多个位点来获得更大的效果(N.Yuyama等人，Biochem.Biophys.Res.Commun.1861271(1992))。利用这种核糖酶，有可能在本发明中特异切割靶基因的转录本，从而抑制基因的表达。
″编码与本发明编码蛋白质的DNA转录本互补的RNA的DNA″的另一个实施方案是编码与本发明编码蛋白质的DNA的转录本互补的dsRNA的DNA。RNAi是将包括与靶基因序列相同或相似的序列的双链RNA(下文中为dsRNA)导入到细胞中抑制导入的外源基因和内源靶基因表达的现象。当将大约40至几百个碱基对的dsRNA导入细胞时，具有解旋酶结构域、称为Dicer的RNaseIII-样的核酸酶，在存在ATP的情况下从3′端切除dsRNA，一次切除大约21至23个碱基对，并产生siRNA(短的干扰RNA)。特异的蛋白质与siRNA结合形成核酸酶复合物(RISCRNA-诱导的沉默复合物)。该复合物识别并结合与siRNA相同的序列，在相应于siRNA的中心的位置通过RNaseIII-样酶活性切割靶基因的mRNA。除这个途径外，siRNA的反义链结合mRNA并且作为引物对于依赖RNA的RNA聚合酶(RsRP)来合成dsRNA。也可认为在该dsRNA再成为Dicer底物的途径中产生新的siRNA以扩增其作用。
上述RNAi最初是在秀丽线虫(Caenorhabditis elegans)中发现的(Fire，A.等人Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA inCaenorhabditis elegans.Nature 391，806-811，(1998))，并且现在不仅已经在秀丽线虫，而且在多种生物体，例如植物、线虫类、果蝇和原生动物中被观察到(Fire，A.RNA-triggered gene silencing.Trends Genet.15，358-363(1999)；Sharp，P.A.RNA interference 2001.Genes Dev.15，485-490(2001)；Hammond，S.M.，Caudy，A.A.&Hannon，G.J.Post-transcriptional genesilencing by double-stranded RNA.Nature Rev.Genet.2，110-1119(2001)；Zamore，P.D.RNA interferencelistening to the sound of silence.Nat.Struct.Biol.8，746-750(2001))。从外部实际导入dsRNA证实了可在生物体中抑制靶基因的表达，这也被用作产生敲除个体的方法。
最初当导入RNAi时，认为dsRNA必须是某一长度(40个核苷酸)或更长才是有效的。然而，Tuschl等人(Rockefeller University，美国.)报道说通过将21个碱基对左右的短链dsRNA(siRNA)导入细胞，甚至在哺乳动物细胞中，可观察到RNAi的效果，而不会由于PKR导致抗病毒反应(Tuschl，Nature，411，494-498(2001))，因此突然RNAi作为适用于分化的哺乳动物细胞，例如人细胞的技术而受到注意。
本发明的DNA包括编码针对靶基因mRNA任何一个区域的反义RNA的反义编码DNA，和编码靶基因mRNA任何一个区域的有义RNA的有义编码DNA，并且反义RNA和有义RNA可从反义编码DNA和有义编码DNA表达出来。也可从这些反义RNA和有义RNA制备dsRNA。
当将本发明的dsRNA表达系统整合到载体等中时，反义RNA和有义RNA可从相同的载体表达出来，或它们可从不同的载体表达出来。例如，反义RNA和有义RNA可分别通过装配到反义RNA表达盒和有义RNA表达盒中而从相同的载体表达出来，在所述表达盒中将可能表达短RNA，例如polIII系统的启动子分别连接到反义编码DNA和有义编码DNA的上游，并且将这些盒以相同方向或相反方向插入到载体中。此外，可组成具有以相反方向安置，以便其在不同链上相对的反义编码DNA和有义编码DNA的表达系统。在这种排列方式中，提供反义RNA编码链和有义RNA编码链成对(siRNA编码DNA)的单个双链DNA，并且可在两侧以相反的方向安置启动子以便反义RNA和有义RNA可从每条链表达出来。在这种情况下，为了避免在有义RNA或反义RNA的下游加入不必要的序列，优选将终止子安置在每条链(反义RNA编码链和有义RNA编码链)的3′末端。可使用4个以上连续的A(腺嘌呤)核苷酸的序列作为终止子。此外，在这种回文表达系统中，优选2个启动子的类型是不同的。
另一方面，反义RNA和有义RNA可分别通过例如装配到反义RNA表达盒和有义RNA表达盒中而从不同的载体表达出来，在所述表达盒中将可能激发表达短RNA，例如polIII系统的启动子分别连接到反义编码DNA和有义编码DNA的上游，并且将这些盒插入到不同的载体中。
在本发明的RNAi中，siRNA可用作dsRNA。术语″siRNA″是指包括在细胞内不显示毒性的范围中的短链、以及不限于如由Tuschl等人(上述)所报道的全长为21至23个碱基对的双链RNA，只要其长度在不显示毒性的范围内。例如，长度可以是15至49个碱基对，优选15至35个碱基对，以及更优选21至30个碱基对。备选地，可以转录待表达的siRNA以使得双链RNA部分的最终长度可以是例如15至49个碱基对，优选15至35个碱基对，以及更优选21至30个碱基对。
形成具有发夹结构的双链RNA(自我互补的′发夹′RNA(hpRNA))、在靶序列的反向重复之间插入适当序列(优选内含子序列)(Smith N.A.等人，Nature，407319，2000；Wesley，S.V.等人Plant J.27581，2001；Piccin，A.等人，Nucleic Acids Res.29E55，2001)的构建体也可用作本发明的DNA。
用于RNAi的DNA不必与靶基因完全相同，但是应具有同一性为至少70％以上，优选80％以上，更优选90％以上，以及最优选95％以上的序列。可通过如上所述的方法确定序列同一性。
在dsRNA中，RNAs成对的双链部分不限于完全成对的双链部分，并且可包括由错配所产生的不成对部分(其中相应的核苷酸不是互补的)、鼓包(其中一条链缺乏相应的核苷酸)等等。在本发明中，其中dsRNA的RNAs成对的双链RNA区域可包括凸起(bulges)和错配。
也可通过转化具有与靶基因序列相同或相似的序列的DNA的共抑制来抑制内源的基因表达。″共抑制″是指将具有与靶内源基因序列相同或相似的序列的基因通过转化导入植物，并且导入的外源基因和靶内源基因的表达受到抑制的现象。尽管共抑制的详细机制是未知的，但经常可在植物中观察到(Curr.Biol.7R793，1997，Curr.Biol.6810，1996)。例如，如果想要获得CKX基因受到共抑制的植物体，可用设计成便于表达CKX基因或具有相似序列的DNA的载体DNA转化所述的植物以选择具有CKX突变性状的植株，即在所得到的植物中选择光照敏感性降低的植株。用于共抑制的基因不必与靶基因完全相同，但是应具有至少70％以上的序列同一性，优选80％以上的序列同一性，以及更优选90％以上(例如，95％、96％、97％、98％、99％以上)的序列同一性。
此外，也可通过用具有靶基因占显性阴性(dominant negative)表型基因转化植物来抑制本发明中的内源基因表达。在此，具有显性阴性表型的基因是指当表达时，该基因可消除或减少植物固有的野生型内源基因的活性。
本发明提供已经插入本发明的DNA或抑制本发明DNA表达的DNA的载体。除用于产生重组蛋白质的上述载体外，本发明的载体也包括用于在植物细胞中表达本发明DNA或抑制本发明DNA表达的DNA的载体，以便产生转化植物。对于所使用的载体类型没有限制，只要它们包含可在植物细胞中引发转录的启动子序列，和包括为转录本的稳定化所需要的多聚腺苷酸位点的终止子序列。实例包括质粒″pBI121″、″pBI221″、和″pBI101″(所有的都来自Clontech)。不特别限制用于转化植物细胞的载体，只要它们可在细胞内表达插入的基因。例如，可使用包括在植物细胞中用于进行组成型基因表达的启动子(例如，花椰菜花叶病毒的35S启动子)的载体，和包括通过外刺激诱导性活化的启动子的载体。在此所使用的术语″植物细胞″包括多种形式的植物细胞，例如悬浮培养细胞、原生质体、叶子切片和愈伤组织。
本发明的载体可包括用于组成性或诱导性表达本发明蛋白质的启动子。用于组成性表达的启动子实例包括花椰菜花叶病毒的35S启动子(Odell等人1985 Nature 313810)、水稻的肌动蛋白启动子(Zhang等人1991 PlantCell 31155)、和玉米的泛素启动子(Comejo等人1993 Plant Mol.Biol.23567)。
用于诱导性表达的启动子实例包括已知由于外因，例如丝状真菌、细菌和病毒的感染和侵入、低温、高温、干燥、紫外线照射和特定化合物的喷涂而激发的启动子。这种启动子的实例包括水稻的壳多糖酶基因启动子(Xu等人1996Plant Mol.Biol.30387)和烟草PR蛋白质基因启动子(Ohshima等人1990 Plant Cell 295)，其受到丝状真菌、细菌和病毒的感染和侵入的诱导、由低温诱导的水稻″lip19″基因启动子(Aguan等人1993Mol.Gen Genet.2401)、由高温诱导的水稻″hsp 80″基因和″hsp 72″基因启动子(Van Breusegem等人1994Planta 19357)、由干燥诱导的拟南芥″rab 16″基因启动子(Nundy等人，1990Proc.Natl.Acad.Sci.USA 871406)、由紫外线照射诱导的查耳酮合酶基因启动子(Schulze-Lefert等人1989 EMBO J.8651)、和由缺氧条件诱导的玉米乙醇脱氢酶基因启动子(Walker等人，1987Proc.Natl.Acad.Sci.USA 846624)。此外，水稻的壳多糖酶基因启动子和烟草的PR蛋白质基因启动子也可受到特定化合物，例如水杨酸的诱导，而″rab 16″也可受到喷涂脱落酸，植物激素的诱导。
此外，本发明提供已经导入本发明载体的转化细胞。除上述用于产生重组蛋白质的细胞外，导入本发明载体的细胞包括用于制备转化植物的植物细胞。对于植物细胞的类型没有特别的限制，实例是拟南芥、水稻、玉米、马铃薯和烟草的细胞。除培养细胞外，本发明的植物细胞包括植物内的细胞，以及原生质体、芽原基(shoot primordia)、复合芽(multiple shoot)和毛根。可通过已知的方法将载体导入植物细胞，例如聚乙二醇法、电穿孔、土壤杆菌介导的转移和粒子轰击。可根据植物细胞的类型从转化的植物细胞通过已知的方法再生植物(Toki等人，(1995)Plant Physiol.1001503-1507)。例如，用于水稻植株的转化转化和再生方法包括(1)利用聚乙二醇将基因导入到原生质体中，并使植物体再生(适于籼稻品种)(Datta，S.K.(1995)in″Gene Transfer To Plants″，Potrykus I和Spangenberg编辑，pp66-74)；(2)利用电脉冲将基因导入到原生质体中，并使植物体再生(适于粳稻品种)(Toki等人(1992)Plant Physiol.100，1503-1507)；(3)通过粒子轰击将基因直接导入到细胞中，并使植物体再生(Christou等人(1991)Bio/Technology，9957-962)；以及(4)利用土壤杆菌导入基因，并使植物体再生(Hiei等人(1994)Plant J.6271-282)。已在本领域中建立这些方法，并且广泛用于本发明的技术领域。这种方法可适当地用于本发明。
可通过使转化的植物细胞再分化而使植物再生。再分化的方法根据植物细胞的类型而不同，实例包括Fujimura等人(Plant Tissue Culture Lett.274(1995))用于水稻的方法、Shillito等人(Bio/Technology 7581(1989))和Gorden-Kamm等人(Plant Cell 2603(1990))用于玉米的方法、Visser等人(Theor.Appl.Genet.78594(1989))用于马铃薯的方法、Nagata和Takebe(Planta 9912(1971))用于烟草的方法、Akama等人(Plant Cell Reports 127-11(1992))用于拟南芥的方法、以及Dohi等人(Unexamined PublishedJapanese Patent Application No.(JP-A)Hei 8-89113)用于桉树的方法。
一旦获得已经将本发明的DNA或抑制本发明DNA表达的DNA整合到其基因组中的转化植物，就有可能通过有性或无性繁殖获得植物的后代。也可能从植物或其后代或克隆获得再生的材料(例如种子、水果、穗状花序(spikes)、块茎(tuber)、块茎状根(tuberous root)、残根(stubs)、愈伤组织和原生质体)，以根据这种材料大量生产该植物。因此，本发明包括已经导入本发明DNA的植物细胞、包含这些细胞的植物、这些植物的后代和克隆，以及该植物的再生材料及其后代和克隆。
当与野生型植物相比时，如此生产的并且其着粒数已经改变的植物显示了其着粒数和产量的变化。例如，预期其中已经通过导入反义DNA等抑制编码CKX蛋白质的DNA表达的植物显示由于其着粒数增加而增产。利用本发明的方法，可增加有用农作物水稻的着粒数。本发明在高产水稻品种的开发中是更为有益的。
此外，本发明提供包括至少15个连续核苷酸的多核苷酸，其与SEQ IDNO1或2的核苷酸序列或其互补序列是互补的。在此，短语″互补的序列″是指相应于双链DNA的一条链的序列，另一条链的序列包括A:T和G:C碱基对。术语″互补的″不限于其中序列与在至少15个连续核苷酸的区域中是完全互补的情况，并且包括其中核苷酸序列的同一性是至少70％，优选至少80％，更优选90％，以及更优选95％以上的情况。这种DNAs可用作检测或分离本发明的DNAs的探针以及用于扩增该DNAs的引物。
此外，本发明提供用于确定植物着粒数增减的基因诊断方法。植物的着粒数是与植物产量紧密相关的，确定植物的着粒数在以增加产量为目的的水稻品种的育种中是很重要的。
在本发明中，短语″确定植物着粒数的增减″不仅包括确定迄今栽培的品种着粒数的增减，而且包括确定通过杂交或遗传重组技术产生的新品种着粒数增减。
本发明的评估植物着粒数增减的方法的特点在于检测植物是否已经丢失编码CKX蛋白质的DNA的功能。可通过检测基因组DNA相应于CKX基因的核苷酸序列中的变化来评估植物是否已经丢失编码CKX蛋白质的DNA的功能。
直接确定相应于本发明DNA的待测植物DNA区域的核苷酸序列后，当核苷酸序列编码其功能缺失导致植物着粒数增加的蛋白质时，确定该植物是具有小的着粒数的品种，或当没有编码该蛋白质时确定该植物是具有大的着粒数的品种。
例如，如果在待测植物DNA的核苷酸序列中发现导致水稻CKX蛋白质的功能缺失的突变，则这个待测植物将被诊断为具有大的着粒数的品种。
例如当通过杂交植物选育良种时，通过本发明的方法评估植物着粒数的增减是极为有利的。例如，当不需要导入增加着粒数的性状时，可避免与具有增加着粒数的性状的品种杂交，相反，当需要导入增加着粒数的性状时，可与具有增加着粒数性状的品种进行杂交。当从杂交后代选择合乎需要的个体时它是更为有效的。与从表型确定相比，可更便利和可靠地在基因水平确定植物着粒数的增减。因此，本发明的用于评估着粒数增减的方法可极大地促进改良植物品种的育种。
附图简述图1显示一组描绘Koshihikari和Habataki的表型的照片。左侧显示的是Koshihikari，而右侧显示的是Habataki。
图2显示染色体上Yielding QTL(YQ)的位置。
图3显示Yielding QTL(YQ)的小型连锁图谱。
图4显示Yielding QTL(YQ)的高分辨率连锁图谱。
图5比较了Koshihikari和Habataki的Yielding QTL(YQ)的高分辨率连锁图谱。
图6显示拟南芥和水稻的CKX基因的系统演化树。
图7比较CKX基因的序列。
图8是图7的继续。
图9是图8的继续。
图10显示水稻中所有的CKX基因位点。
实施本发明的最佳方式在下文中，本发明参考实施例进行具体地说明，但不应被认为只限于此。
试验材料的选择和半等基因系的产生最初，为了产生用于QTL分析的杂种群体，选择将成为杂种亲本的品种。首先，研究了几个粳稻(japonica)品种和几个籼稻(indica)品种中的着粒数，从这些品种中，2个品种显示着粒数的明显差异，选择出粳稻品种“Koshihikari”和籼稻品种“Habataki”(图1)。对于通过将粳稻″Koshihikari″与″Habataki″杂交而产生的F1个体，利用Koshihikari作为重复的亲本进行回交并且进行自交，在名古屋大学农场培养和发展出74个各种的BC2F1、BC2F2和BC3F2群体。
通过利用74个BC2F2植株进行关于着粒数的QTL分析，检测增加着粒数的大量QTL(图2)。特别地，成功地发现位于1号染色体短臂中大约28cM的Habataki的QTL(YQ1；Yielding QTL 1)与Koshihikari的QTL相比极有效的增加谷粒(或种子)的数目。为了检验YQ1的存在，利用重复回交和MAS产生YQ 1的半等基因系(Ni1-YQ1将Habataki的基因座，1号染色体短臂中大约28cM的位点取代入Koshihikari的染色体的品种)。研究Ni1-YQ1和Koshihikari(对照)的最大着粒数，结果证实了QTL(YQ1)的存在。用Habataki的基因座取代1号染色体短臂中大约28cM位点的品种其着粒数平均增加了50。
QTL分析从每一74个BC2F1个体中，利用CTAB法提取DNAs，利用完全覆盖所有染色体的93个分子标记物确定每一个体的基因型。在每个品种的10个个体发展出它们的自交后代，BC2F2，并且从中随机选择每个品种的一个个体，在从每一选择个体取样6个圆锥花序后，对于每个圆锥花序研究着粒数。在每一品种的6个圆锥花序中，选择具有最大着粒数的圆锥花序，并将这个数目用作最大着粒数。利用Qgene软件进行QTL分析。
利用YQ的分离群体的高分辨率连锁分析利用分子标记物，使用BC3F2群体研究表型和基因型(F2和F3)，并且再进行连锁分析。结果表明YQ1位于分子标记物6A和8A之间的区域(图3)。利用YQ的分离群体(12500个个体)进行高分辨率连锁分析来表示YQ1位点区域的结果是，表明YQ1是标记物4A9和20之间的大约8Kb位置的区域(图4)。当在这个区域中进行基因预测时，预测到单个基因，同源性搜索的结果是发现与CKX(细胞分裂素氧化酶)高度同源的基因(图4)。当对Habataki和Koshihikari确定这个CKX基因的核苷酸序列时，发现了核苷酸中的差异，Habataki的CKX似乎已经丢失其功能(图5)。
水稻基因组中CKX基因的分析当搜索水稻基因组序列分析水稻中的CKX基因时，在水稻基因组中发现11个CKX基因。当对于这些基因以及拟南芥中的CKX基因构建系统演化树时，发现拟南芥的AtCKX2、3、和4，以及5个水稻CKX基因(位于Chr.125cM P695A4的CKX、位于Chr.127P419B01的CKX(本基因)、位于Chr.679cM OsJ0006A22-GS的CKX基因、和2个位于32cM的CKX基因)是极紧密相关的(图6)。当研究这些基因的同源性时，发现它们在氨基酸水平是高度同源的(图7至9)。此外，当证实了水稻中所有CKX基因的基因座位置时，发现其中一些位于YQ区域上(图10)。
工业实用性由本发明提供的CKX基因的功能缺失增加了植物的着粒数。因此，利用例如反义法和核糖酶法的方法调节该DNA的表达可导致谷粒产率的增加。因为在谷物中基因组同线性(遗传同源性)是高度保守的，可以预期将水稻CKX基因应用在繁殖谷物，例如小麦、大麦和玉米中。此外，因为CKX基因不限于谷物，并且广泛分布于植物中，CKX基因功能的缺失可能增加所有植物的花和种子(颖花)的数目，而导致产量的增加。
此外，本发明提供用于确定植物中着粒数增减的遗传诊断方法。可更方便地在基因水平进行植物着粒数增减的确定并且可靠地与来自表型的确定进行比较。因此，本发明的用于评估着粒数增减的方法可极大地促进改良植物品种的育种。
序列表<110>HONDA MOTOR CO.，LTD.(本田技研工业株式会社)<120>用于增加作物产量的基因及其用途<130>H3-A0201P<150>US 60/425,919<151>2002-11-13<160>6<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>5400<212>DNA<213>稻(Oryza sativa)<220>
<221>内含子<222>(1)..(108)<223>
<220>
<221>外显子<222>(109)..(817)<223>
<220>
<221>内含子<222>(818)..(908)<223>
<220>
<221>外显子<222>(909)..(1375)<223>
<220>
<221>内含子<222>(1376)..(3823)<223>
<220>
<221>外显子<222>(3824)..(4089)<223>
<220>
<221>内含子
<222>(4090)..(4540)<223>
<220>
<221>外显子<222>(4541)..(5400)<223>
<400>1acagctctac tgtctatcta gctatctatc agctgccttc catcgtcagc acacaaacta 60cacaagaatc tgcttattta taggccacct tgtcccttct acaatggtgc aagaacacac 120aaattcacac acacactgac acacacaaac cgatcgattg attgattgat a atg aag 177Met Lys1caa gag cag gtc agg atg gca gtg ctc ctc atg ctc aac tgc ttc gtc225Gln Glu Gln Val Arg Met Ala Val Leu Leu Met Leu Asn Cys Phe Val5 10 15aag gcc acg gcg ccg ccg cca tgg ccg ccg tcg gct tcg tcc gcc tcc273Lys Ala Thr Ala Pro Pro Pro Trp Pro Pro Ser Ala Ser Ser Ala Ser20 25 30ttc ctc gac gac ctc ggc gac ctc ggc atc gcg ccg ctc atc cgc gcc321Phe Leu Asp Asp Leu Gly Asp Leu Gly Ile Ala Pro Leu Ile Arg Ala35 40 45 50gac gag gcg ggc acc gcg cgc gcc tcc gcc gac ttt ggc aac ctc tcc369Asp Glu Ala Gly Thr Ala Arg Ala Ser Ala Asp Phe Gly Asn Leu Ser55 60 65gtc gcc ggc gtc ggg gcg cct cgg ctc gcc gcc gcc gcc gcc gtg ctc417Val Ala Gly Val Gly Ala Pro Arg Leu Ala Ala Ala Ala Ala Val Leu70 75 80tac ccg tcg cgc ccc gcc gac atc gcc gcg ctg ctg cgc gcg tcg tgc465Tyr Pro Ser Arg Pro Ala Asp Ile Ala Ala Leu Leu Arg Ala Ser Cys85 90 95gca cgc ccg gcg ccg ttc gcg gtg tcc gcg cgg ggg tgt ggc cac tcg513Ala Arg Pro Ala Pro Phe Ala Val Ser Ala Arg Gly Cys Gly His Ser100 105 110gtg cac ggc cag gcc tcc gcg ccc gac ggc gtc gtc gtc gac atg gcg561Val His Gly Gln Ala Ser Ala Pro Asp Gly Val Val Val Asp Met Ala115 120 125 130tcg ctc ggc cgc ctg cag ggc ggc ggc gcg cgg cgc ctc gcc gtg tca609Ser Leu Gly Arg Leu Gln Gly Gly Gly Ala Arg Arg Leu Ala Val Ser135 140 145
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权利要求
1.一种编码其功能缺失导致植物着粒数增加的植物来源蛋白质的DNA，其中该DNA是(a)至(d)中的任意一项(a)编码包括SEQ ID NO3的氨基酸序列的蛋白质的DNA；(b)包括包含SEQ ID NO1或2的核苷酸序列的编码区的DNA；(c)编码包括SEQ ID NO3的氨基酸序列的蛋白质的DNA，其中已经取代、缺失、添加、和/或插入了一个或多个氨基酸；以及(d)在严谨条件下与包括SEQ ID NO1或2的核苷酸序列的DNA杂交的DNA。
2.权利要求1的DNA，其中该DNA来源于水稻。
3.编码与权利要求1或2的DNA的转录本互补的RNA的DNA。
4.编码具有特异切割权利要求1或2的DNA转录本的核糖酶活性的RNA的DNA。
5.编码通过在植物细胞中表达时的共抑制效果而抑制权利要求1或2的DNA表达的RNA的DNA。
6.包括权利要求1至5中任意一项DNA的载体。
7.用权利要求6的载体转染的宿主细胞。
8.用权利要求6的载体转染的植物细胞。
9.包括权利要求8的植物细胞的转化植物。
1O.权利要求9的转化植物的后代或克隆的转化植物。
11.权利要求9或10的转化植物的繁殖材料。
12.用于生产转化植物的方法，其中该方法包括将权利要求1至5中任意一项DNA导入到植物细胞中，以及从所述的植物细胞再生植物体的步骤。
13.由权利要求1或2的DNA编码的蛋白质。
14.用于生产权利要求13的蛋白质的方法，其中该方法包括培养权利要求7的宿主细胞，以及从所述的细胞或其培养物上清液收集重组蛋白质的步骤。
15.结合权利要求13的蛋白质的抗体。
16.一种多核苷酸，其包括与SEQ ID NO1或2的核苷酸序列互补的至少15个连续核苷酸，或其互补序列。
17.用于增加植物着粒数的方法，其中该方法包括在植物体的细胞中表达权利要求3至5中任意一项的DNA的步骤。
18.用于改变植物着粒数的试剂，其中该试剂包括权利要求1至5的任意一项DNA或权利要求6的载体作为活性成分。
19.一种用于确定植物着粒数的方法，其中该方法包括下列步骤(a)从待测植物体或其再生培养基制备DNA样品；(b)扩增所述DNA样品的相应于权利要求1的DNA的区域；以及(c)确定所扩增的DNA区域的核苷酸序列；其中当该核苷酸序列编码其功能缺失导致植物着粒数增加的蛋白质时，确定该植物是具有小的着粒数的品种，而当没有编码所述的蛋白质时，确定该植物是具有大的着粒数的品种。
全文摘要
通过连锁分析成功地分离和鉴定了调节植物着粒数(包括颖花、果实和种子)增减的基因。此外也发现了利用该基因增加植物的着粒数(包括颖花、果实和种子)的育种方法。本发明可用于例如培育改良的植物品种的领域。
文档编号C12N5/14GK1742085SQ20038010873
公开日2006年3月1日申请日期2003年11月13日优先权日2002年11月13日
发明者芦苅基行, 松冈信, 林少扬, 山本敏央, 西村明日香, 高师知纪申请人:本田技研工业株式会社