Guide Book 微生物样本您可以这样取····

微生物多样性分析是以研究某一环境中微生物的种类和数量为目标，进一步揭示在 这一“生 境”中随着组分的改变，微生物的群体结构发生变化的过程。同时我们也可以通过研究微生物的改变情况解释生活中的一些现象。比如：在不同的环境条件下腌制的咸菜为什么口感不一样？为什么会想念小时候妈妈做饭的味道，这可 不光是一种情感上的思念，微生物也是有功不可没的原因的......但是要想有一个好的微生物多样性分析结果，就需要在前期对使用的原材料进行严格的筛选，下面就让百迈客实验小达人带您一起来看看组织样本的制备吧------

样品制备五大原则

标本采集是否符合要求，直接影响检验质量。因此要求做到以下几点：

工具的无菌性：采集样本使用的所有工具应该进行无菌消毒处理，避免因外源菌的引入造成实验的；

设计的代表性：根据实验目的设计科学的取样方式和采样地点，实验结果应该具有严谨的科学意义；

采集的准确性：采集的样品根据实验的设计采集样本，采集的样本中不能掺杂有非研究物品或者对实验结果有影响的物品；且需要根据目的菌的种类（需氧菌、厌氧菌等）采用不同的方法采集样本；

条件的低温性：采集完成之后，迅速处理样本，低温保存，尽量保证实验组样本菌群的原始性

实验的重复性：每组实验应该设有生物学重复，避免因偶然造成实验的误差；

注意事项：生物学重复的设置

微生物多样性课题研究中，生物学重复的设置是一个很重要的问题，那么，生物学重复应该怎么设置呢？

"生物学重复"指的是经过相同方式处理的相同样品。设置生物学重复对于后续实验的可靠性验证具有重要作用，也是一般发文章的必要要求，进行微生物多样性研究时，自然环境中的样本，比如水体，土壤等，建议每组至少6个生物学重复，一般建议10个生物学重复 ；对于复杂环境的样本，比如个体差异较大，则需要设置更多的生物学重复，比如人粪便，皮肤，唾液等样本，建议至少10个生物学重复 。

表1.常见微生物多样的常见样本类型

图1：土壤样本取样剖面图-根据根系土壤的年份及深度设计实验

一、土壤样本的具体取样步骤

1、普通土壤样本的取样方法

A. 根据研究目的选择有代表性的取样地点及采样点；

B. 除去土壤表层未分解的凋落物层，用已灭菌的刀或铲去除表层5cm的土壤，再用烧灼过的勺、铲或土壤取样器取样10-25g，装于无菌塑料封口袋内，多点样本均匀混合（注意保留适当空间） ，标明采样地点，深度、日期等信息；

C. 两天内常温或冰袋运送到实验室，除去动植物残体、石砾等杂质，将大块的样品捣碎，过 2mm 筛后，分装至2mL 或更大体积的EP管或冻存管中；每管土壤含量大概0.25~0.5g，需保证送样量在1~2g，若土壤含微生物较少，需增加送样量；

D. 未分装样本4 ℃保存时间不要超过一个月，分装后样本-80℃或液氮中长期保存；

E. 运送方式：干冰运输。

示例图：一次提取所需土壤（2.0ml离心管）

2、根系土壤样本

A.选取好采样地点之后，收集植物植株，去除根部大块土壤；摇动植株去除附着不紧密的土壤，使用无菌刷子收集根部附着紧密的土壤；随机多点取样5-10g，装于无菌塑料封口袋内，多点样本均匀混合（注意保留适当空间） ，标明采样地点，深度、日期等信息；

B. 两天内常温或冰袋运送到实验室，除去动植物残体、石砾等杂质，将大块的样品捣碎，过 2mm 筛后，分装至2mL 或更大体积的EP管或冻存管中；每管土壤含量大概0.25~0.5g，需保证送样量在1~2g，若土壤含微生物较少，需增加送样量；

C. 未分装样本4 ℃保存时间不要超过一个月，分装后样本-80℃或液氮中长期保存；

D.运送方式：干冰运输。

二、污泥样本

A. 根据研究目的选择有代表性的取样地点及采样点；

B. 采集污泥样品，放于无菌离心管或其它无菌容器中；

C. 4小时内常温带回实验室中分装至2mL EP管或冻存管中；或用PBS进行清洗，使用PBS的体积需是淤泥样本的3-10倍，摇床混匀孵育1-2h或者使用超声波清洗仪清洗15-30min，瞬离（转速达到800g即可停止），将上清液转至新的合适体积的离心管中，8000g4℃离心10min收集沉淀或下层，分装于2 mL离心管中；每个样品至少2g；

D. 分装后样本迅速液氮速冻，之后放于-80°C 或液氮中长期保存；

E.运送方式：干冰运输。

三、水体样本

A. 根据研究目的选择有代表性的取样地点及采样点；

B. 采用多点取样法取样，采样时不可搅动水底的沉积物；避免手指和其他物品对瓶口的沾污；

C. 取样后4小时内（期间4 ℃避光保存）真空抽滤、富集菌体（平行重复 样本可用同一滤膜过滤）；

D. 带有富集菌体的干燥滤膜（直接保存，剪碎或者折叠有可能吸附菌体的一面会粘在一起，不利于提取时裂解洗脱菌体）保存在 2mL或5mL 无菌EP管中， -20 ℃或-80℃保存；

E. 如果没有滤水设施，可将水体收集后，使用50ml无菌离心管8000g4℃离心10min收集下层；

F. 运送方式：干冰运输；

注意事项！

a. 过滤大量低微生物含量的清亮水样用0.22μm 的聚苯醚砜滤膜（Polyethersulfone），每个样本至少1L水样。

b. 浑浊水样使用0.22μm滤膜过滤缓慢容易堵塞时，建议使用0.45μm的混合纤维素酯滤膜（膜醋酸纤维素、硝酸纤维素）；如水体中含有杀虫剂和除草剂，则避免使用这类滤膜；每个样本0.5L-1L水样，如有堵塞则将同一样本滤膜保存于一管。

c. 如果水样中不可溶解的颗粒较多，需要使用2-5μm孔径的滤膜将不可溶解的颗粒杂质滤去，再使用0.22μm或0.45μm的滤膜富集菌体；每个样本0.5L-1L水样，如有堵塞需则同一样本滤膜保存于一管。

d. 如果研究的是病毒，则需先用 0.22μm 滤膜把水中的细菌和其它大个头细胞过滤掉，再用带正电荷滤膜（ Virozorb 的 1MDS 或NanoCeram 的 Virus Sampler cartridges）富集病毒；每个样本20L 水样。

e. 微生物含量低的清亮水体可使用多管50ml分装离心后，合并下层进行二次离心富集

四、 植物根系表面微生物

A.选择好采样地点之后，使用无菌工具将取样植株取出，不要损伤植物根系，摇动植株去除附着不紧密的土壤，使用无菌刷子去除根部附着紧密的土壤；

B. 将植物根剪成小段，放入无菌的1X的PBS中，摇床孵育20min，转入超声仪中超生20min，再次重复摇床和超生操作一次，取出植物根；

C. 将富集到的水体使用12000rpm4℃离心10min，收集下层混合物，-80℃或液氮中长期保存；

D.运送方式：干冰运输。

五、动物肠道内容物

1.普通动物肠道内容物

A. 在实验对象死亡后，无菌条件下，取出整个肠道，用无菌解剖刀切取所需肠段的；

B. 用无菌手术刀挖取内容物，并立即放在冰上进行分装及标记；

C. 将已取的样品分装至2mL EP管（无菌）或冻存管（无菌）中，每管组织量为0.5~2g，每个样品分装2~3管备份；

D. 分装好后样本迅速放入液氮中速冻，之后放于-80℃或液氮中长期保存；

E. 运送方式：干冰运输；

注意事项：

一些肠道内容物较难取样的可以取肠道样本作为研究对象，这种我们采用测内生菌的测序手段（但需备注难取样测内生菌）。将肠道剪成肠断，置于无菌离心管中，液氮速冻，-80℃长期保存，干冰运输；

2.飞虱类昆虫肠道样本

A. 取褐飞虱成虫200+头，用冰（-20℃冷冻）使其昏迷，用70%乙醇进行表面灭菌处理，在用灭菌水漂洗数次；

B. 解剖镜下用镊子夹住飞虱的头胸部和腹末，轻轻用力将肠道以及内脏器官拉出，用灭菌水漂洗，去除卵巢、脂肪以及其他内脏器官，取出肠道放于1.5mL离心管，每管组织量为0.1~0.25g，每个样品分装2管备份；

C. 分装好后样本迅速放入液氮中速冻，之后放于-80℃或液氮中长期保存；

D. 运送方式：干冰运输；

六.物体表面微生物样本

A. 根据研究目的选择有代表性的取样地点及采样点；

B. 采集样品，放于无菌离心管或其它无菌容器中；

C. 4小时内常温带回实验室中，取10g样品（评估物体表面微生物含量确定样本量）加入50-100mL的PBS缓冲液或者无菌水，150-200r/min振荡30-60min，超声5min，再150-200r/min振荡30-60min，取上清液加入到50mL离心管中，8000-10000g离心收集沉淀。若沉淀不明显可过0.22uM的可拆卸的滤膜，一个样品最好富集多个滤膜，以便提高提取效率，将过滤好的滤膜置于无菌离心管中，液氮速冻，-80℃或液氮中长期保存；

D. 也可使用无菌脱脂棉签或者拭子擦拭物体表面，保证取样的准确性即可，反复擦拭30次左右，液氮速冻，干冰运输；

E. 运送方式：干冰运输；

七、 植物内生菌

A. 根据研究目的选择有代表性的取样部位；

B. 采摘新鲜植物样品，用流水冲洗干净去除表面泥沙，用乙醇和次氯酸钠进行消毒后，将研究部位（根、茎、叶）使用无菌水振荡（或超生波）洗涤多次，清洗后的植物（根、茎、叶）置于无菌EP管中，每个样本2g，-80℃冰箱保存，可用来研究植物内生菌；

C. 运送方式：干冰运输；

注意：

组织消毒方式：组织较柔软部位（如叶、花）放入80%乙醇溶液中消毒2min；组织较硬部位（如根）放入80%乙醇溶液中消毒1min，再放入1%次氯酸钠溶液中消毒5min，最后放入80%乙醇溶液中消毒1min。

八、粪便样本

A. 带上手套收集新鲜的粪便样品；

B. 无菌牙签或粪便取样器截取样品中段内部（避免表层中的肠道膜脱落细胞），外部容易污染且细菌DNA由于接触空气可能有降解；

C. 将已取的粪便样品分装至2mL EP管（无菌）或冻存管（无菌）中，每管粪便量为0.5~2g，每个样品分装2~3管备份（小鼠样本一次提取1-2粒，大鼠粪便一次提取0.5-1粒）；

D. 分装好后样本迅速放入液氮中速冻，之后放于-80℃或液氮中长期保存；

E. 运送方式：干冰运输；

九、生物膜样本

A. 根据研究目的选择有代表性的取样地点及采样点；

B. 用脱脂棉将生物膜上的微生物擦拭干净，脱脂棉立即放入样品瓶中，并加入50mL灭菌的生理盐水（或者1X的PBS），盖盖，用力震荡20min，使脱脂棉上生物膜微生物进入水中，形成悬浮菌液；

C. 悬浮的菌液用0.22um的滤膜过滤。将滤膜折叠、剪碎置于无菌离心管中，液氮速冻，-80℃长期保存；

D. 运送方式：干冰运输；

十、 空气样本

A. 开动采样仪（浮游细菌采集器），使被测空气滤过凝胶膜（灭菌），空气中的浮游菌被截留在凝胶膜上（过滤时间越长，收集的空气中的灰尘越多，菌数量越多），不能使用自制脂类膜收集水体菌，脂类膜在提取时加热会溶解，预冷会凝固，不利于提取；

B. 取下滤膜，液氮速冻，-80℃保存；

C. 运送方式：干冰运输；

十一、发酵类样本

A. 酒糟、豆瓣酱等发酵类组织，采集样本时先选择好采集的样本类型（比如酒糟）；

B. 使用无菌工具去除掉酒糟表面的部位；

C.可以选择不同深度或者不同发酵时间的酒糟作为实验对象，再铲取不同位置的组织分别装到无菌管中作为平行样本，液氮速冻，-80℃保存；

D. 运送方式：干冰运输；

最后为了给老师一个更好的实验体验，有一些送样事项需要注意：

1 、客户取样时注意留重复，自己做生理实验或者PCR，公司提取量少，验证可能不够；

2 、建议冻存管送样，管口用封口膜包裹，防止运输过程盖子掉落；

3 、样本编号不易过长，也不要含符号，书写在管口或管壁，严禁用标签纸黏贴（低温运输极易掉落）；

4 、样本的编号更加规范简洁一些，方便沟通和核对：例如 A1，A2，A3，A4，A5，B1，B2，B3，B4，B5， C1，C2，C3，C4，C5;

5 、送样时强调每组样本小袋子单独封装；样本总数大于30的，建议盒子送样，并按样本信息单顺序装到盒子中；

6、送样时单管样品满足3次提取的量即可，最好送样是每个实验组可以送多个重复，单管够满足1次提取量即可，剩余组织作为备份;

7、土壤样本有需求准确称量提取核酸的，需要老师自己称量做好标记好之后单管送样，明确说明一次提取使用，单管送样的量不能超过500mg（参考示例图：一次提取所需土壤（2.0ml离心管）。

内容：杨玉平

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