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一种绿花石莲种质保存与商业化快繁方法与流程

来源：花匠小妙招时间：2025-09-16 07:14

本发明涉及植物组培扩繁，具体涉及一种绿花石莲种质保存与商业化快繁方法。

背景技术：

1、本节中的陈述仅提供与本技术公开相关的背景信息，并且可能不构成现有技术。

2、绿花石莲（ sinocrassula indica var. viridiflora k. t. fu）为景天科（crassulaceae）石莲属（ sinocrassula）的多年生草本植物，主要分布于云南中部至北部海拔1500-3000 m的石灰岩地区，包括大理、丽江、昆明等地。绿花石莲多生长于岩石缝隙或陡峭崖壁，种群呈斑块状分布，生境特殊且脆弱。据最新调查，绿花石莲的数量稀少且容易受到外来入侵种的威胁，其野生种群已处于易危（vu）等级。绿花石莲具有重要的生态价值和观赏价值，其独特的莲座状株型和灰绿色叶片极具观赏性，是高山多肉植物造景的珍稀材料。绿花石莲叶片中富含黄酮类化合物，具有显著的抗氧化活性，潜在药用价值值得深入开发。此外，作为石灰岩地区先锋植物，绿花石莲在石漠化治理中发挥重要作用，其根系可分泌有机酸溶解岩石，促进土壤形成。

3、多肉植物在自然界中具有性和无性两种生殖方式，有性生殖虽能产生变异，有利于进化与适应，但其种子发芽率低、周期长，需2-3年甚至更长时间才能开花；而营养繁殖如珠芽、匍匐茎、叶片等虽能保持母本特性，但繁殖系数有限且极易感染病虫害。多肉植物的人工繁殖方法主要包括扦插、嫁接和组织培养。扦插繁殖操作简单、成活率可达90%左右，但受季节限制且繁殖系数有限；嫁接可快速获得优良性状，但技术要求高，接口易感染。组织培养则可实现大规模快速繁殖，年繁殖系数可达105-106，展现了其在多肉植物商业应用上的广阔前景。近年来，多肉植物离体培养技术取得显著突破，主要集中在外植体选择、再生体系优化和培养环境调控等方面，取得了一些成果；但仍存在多数研究依赖tdz诱导体细胞胚的形成，导致成本高、畸形苗比例大、重复率低等问题。

4、在多肉植物的离体快繁中，获得再生植株的途径主要有3种：（1）直接器官发生途径，使用外植体如叶片直接分化出不定芽，无需经过愈伤组织阶段；（2）间接器官发生途径，外植体如叶片、花序先形成愈伤组织，再通过植物生长调节剂诱导愈伤组织分化为不定芽和根；（3）体细胞胚胎发生途径，包含两种模式：直接体细胞胚胎发生——体细胞在离体培养条件下直接分化为胚胎，无需经过愈伤组织阶段；间接体细胞胚胎发生——体细胞先脱分化为愈伤组织，随后愈伤组织中的某些细胞再分化为胚胎。这3种途径中，直接器官发生途径无需经过愈伤组织阶段，直接从外植体分化出芽或根，能够缩短培养周期，并且能减少愈伤组织长期培养中的污染概率，但仅适用于再生能力强的多肉，对难再生物种效率低，但需选用幼嫩、健康的外植体；老叶或受损组织再生能力显著下降。间接器官发生适用性广，通过愈伤组织阶段可突破外植体直接再生能力的限制，适用于再生困难的多肉，愈伤组织可长期保存并大量增殖，适合商业化生产，但也存在培养周期长的问题。体细胞胚胎发生则再生效率高，但需严格调控激素和培养条件，否则易出现畸形胚或发育停滞等问题。

5、公开号为cn106613988b的现有技术文件公开了一种瓶内塑型快速培育难扦插繁殖的拟石莲属商品小盆栽方法，以含叶基部腋芽分生组织的叶片组织为无菌诱导外植体，采用方式（1）直接器官发生途径，采用诱导培养基（ms+zt 1.0～2.0mg/l+naa 0.1～0.2mg/l+硫酸腺嘌呤30～50mg/l+蔗糖25～30g/l+琼脂6.0～7.0g/l，ph值为5 .5～6 .0）直接进行丛芽诱导，不经过愈伤组织阶段；诱导出的丛芽采用增殖培养基（ms+zt 0 .2～0 .3mg/l+naa 0 .1～0 .2mg/l+硫酸腺嘌呤30～50mg/l+蔗糖25～30g/l+活性炭300～500mg/l+琼脂6 .0～7 .0g/l，ph值为5 .5～6 .0）进行诱导增殖；随后采用壮苗生根培养基（1/2ms+naa 0 .3～0 .5mg/l+蔗糖25～30g/l+活性炭300～500mg/l+琼脂6 .0～7 .0g/l，ph值为5.5～6.0）进行生根诱导。该现有技术采用含叶基部腋芽分生组织的叶片组织作为外植体，并采用多种诱导培养基配合进行诱导，不经过愈伤组织阶段，繁殖系数低，周期内得到的小苗数量有限。

技术实现思路

1、本发明的目的在于：针对目前现有技术存在的问题，提供了一种绿花石莲种质保存与商业化快繁方法，通过建立以成熟叶片为外植体的无菌培养体系，优化得到绿花石莲的胚性愈伤组织诱导培养基、体细胞胚胎发生及植株再生培养基的影响，成功诱导得到胚性愈伤组织，实现高效增殖，从而建立其稳定而高效的再生体系。研究结果对实现绿花石莲这一高价值特有植物的种质资源保护与商业化可持续利用具有紧迫性和生态经济双重价值。

2、本发明的技术方案如下：

3、一种绿花石莲种质保存与商业化快繁方法，包括如下步骤：

4、步骤s1：胚性愈伤组织增殖：从无菌苗中取得外植体材料，接种于胚性愈伤组织增殖培养基中诱导得到胚性愈伤组织；

5、所述胚性愈伤组织增殖培养基为：1.0mg/l-2.0 mg/l 6-ba + 0.5mg/l-1.0 mg/lnaa或者1.0mg/l-2.0 mg/l 6-ba + 0.5mg/l-1.0 mg/l 2,4-d；

6、步骤s2：愈伤-体细胞胚混合物增殖：步骤s1获得的胚性愈伤组织进一步发育将成为愈伤-体细胞胚混合物，将步骤s1获得的愈伤-体细胞胚混合物切割为适宜接种的小块后，接种于愈伤-体细胞胚混合物增殖培养基中进行增殖诱导得到丛生芽；

7、步骤s3：将步骤s2中诱导得到的丛生芽分为单株后接入空白ms培养基进行过渡培养；当试管苗高约1.5-2.0 cm具15-20个肥厚叶片时，进行驯化移栽。

8、根据一种优选的实施方式，所述步骤s1中胚性愈伤组织增殖培养基更优选为1.5mg/l-2.0 mg/l 6-ba + 1.0 mg/l 2,4-d。

9、根据一种优选的实施方式，所述步骤s1中胚性愈伤组织增殖培养基更优选为1.5mg/l 6-ba + 1.0 mg/l 2,4-d。

10、根据一种优选的实施方式，步骤s2中，所述愈伤-体细胞胚混合物增殖培养基为：1.0mg/l-1.5 mg/l 6-ba + 0.5 mg/l-1.5 mg/l naa + 0.5 mg/l-1.0 mg/l 2,4-d；

11、根据一种优选的实施方式，步骤s2中愈伤-体细胞胚混合物增殖培养基为1.5 mg/l 6-ba + 0.5 mg/lnaa +1.0 mg/l 2,4-d。

12、根据一种优选的实施方式，所述步骤s4中，将步骤s3中成苗培养后长成的扁球状丛生芽分为单株后再接入空白ms培养基进行过渡培养。步骤s2和步骤s3之间还包括步骤s2.1：将步骤s2中增殖获得的愈伤-体细胞胚混合物分割为2-3株幼苗并带少量胚性愈伤组织重新接入步骤s2的培养基中进行成苗培养；优选地，所述少量胚性愈伤组织为肉眼可见即可。

13、根据一种优选的实施方式，所述步骤s2中的“适宜接种的小块”为0.5cm-1.2cm×0.5cm-1.2cm。

14、根据一种优选的实施方式，步骤s1-s3的组织培养中，培养室温度控制在22 ± 1℃，光照强度1500-2000 lx，光照时间10 h/d。

15、根据一种优选的实施方式，在步骤s1前还包括如下步骤s0：通过选取生长发育良好、健壮的叶片为外植体，接种至无菌苗培养基中培养扩大得到第一批无菌苗，从无菌苗中取得更多外植体材料。优选地，所述无菌苗培养基能够为市面现有的通用多肉植物培养基，能够实现扩繁即可。

16、根据一种优选的实施方式，步骤s0中，所述无菌苗培养基为：ms + 1.0mg/l 6-ba+ 1.0 mg/l naa。

17、与现有的技术相比本发明的有益效果是：

18、1、一种绿花石莲种质保存与商业化快繁方法，本技术在不使用tdz的情况下基于植物生长激素的组合即诱导得到了体细胞胚，并且诱导率高，增殖系数最高可达7.5；同时避免了tdz存在的成本高、畸形苗比例大、重复率低的问题；未出现畸形和发育迟缓的问题；

19、2、一种绿花石莲种质保存与商业化快繁方法，本技术基于体细胞胚发育方式，将体细胞先诱导成为体细胞胚型愈伤组织，显著提升了繁殖系数，在诱导愈伤组织过程中繁殖系数达到6.5-7.5，在进一步增殖培养后愈伤组织繁殖系数进一步达到9.5-12；进行成苗培养60 d后，成苗系数达到12.5。若此时用叶片为材料继续转接，则有62.5的增殖系数；加上愈伤-体细胞胚混合物的11.6，则增殖系数达到了可观的70以上。

20、3、一种绿花石莲种质保存与商业化快繁方法，本技术中采用遇上愈伤-体细胞胚混合物的高效增殖，配合步骤s4中将分株培养后进一步长出的小苗再通过物理分离的方式分为单株进行成苗培养，将成苗系数从不经过物理分离时的3.1提升至12.1。

21、4、一种绿花石莲种质保存与商业化快繁方法，成苗培养后的小苗经驯化培养后存活率为100%，植株完成形态建成并维持正常生理状态；虽然前期建立体系时相对耗时，但体系建成后，通过对愈伤-体细胞胚混合物的进一步继代增殖，后续培养进程即可实现从愈伤-体细胞胚混合物开始进一步诱导而无需从外植体开始，操作简单、繁殖系数高、成苗率高同时兼顾效率，具有显著的优势。本体系不仅为绿花石莲的种质保存提供了技术支撑，也为多肉植物商业化繁殖中激素配比优化与形态调控提供了理论参考。