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第六章生物多样性测定

来源：花匠小妙招时间：2024-10-05 13:08

1、第六章生物多样性测定一、遗传多样性的检测遗传多样性是生物多样性的重要组成部分，从某种程度上说它是生态系统多样性和物种多样性的基础和核心。遗传多样性的最直接的表现形式是遗传变异水平的高低。但是，对于任何个体来说，其生命总是很短暂的，由个体构成的种群或种群系统(例如种、亚种)才是在时间上是连续不断的，才是进化的基本单位，这些种群或者种群系统在自然界有其特定的分布格局，所以遗传多样性不仅包括变异水平的高低，同时也包括变异的分布格局，即种群的遗传结构。对于大范围的异交植物来说，种群之间的遗传变异会明显增加，种群遗传结构上的差异是遗传多样性的重要表现，一个物种的进化潜力和抵御不良环境的能力取决于种内遗传变异的大小，同时也有赖于遗传结构。遗传结构是遗传变异在种群内和种群间的分布。它包括基因的种类及比例，而基因型的种类及比例、基因频率及演化规律是种群遗传结构的核心问题。因此研究种群遗传结构有利于阐明自然条件下的生物变异。人们对遗传多样性的检测最初是从形态学开始的。随着染色体的发现及其结构和功能的澄清，人们又把研究的重点转向染色体上。上世纪60年代，酶电泳技术以及特异性组织化学染色法应用于群体遗传

2、和进化研究，使科学家们从分子水平来客观地揭示遗传多样性成为可能，并极大地推动了该领域的发展。进入80年代，分子生物学和分子克隆技术的发展带来了一系列更为直接的检测遗传多样性的方法，即直接测定遗传物质本身DNA序列的变异。从不同水平上检测遗传多样性的各种方法在灵敏度、可行性以及检测目的等方面差别很大，目前检测遗传多样性的常用手段基本上是以形态学性状为主的表型分析和分子水平的检测。1、形态学（表型）检测从形态学或表型性状上来检测遗传变异是最古老也最简便易行的方法。由于表型和基因型之间存在着基因表达、调控、个体发育等一系列复杂的中间环节，如何根据表型性状上的差异来反映基因型上的差异就成为用形态学方法检测遗传变异的关键。通常所利用的表型性状主要有两类。是符合孟德尔遗传规律的单基因性状(如质量形态性状、稀有突变等型性状)，如豌豆的花色、种子形状，果蝇的眼色、翅形，人类的ABO血型等；居群中出现的一些稀有突变(如植物的白化、花柱异长等)。由于生物居群中这类单基因性状很少，而且一些稀有突变往往对生物体具有有害。如致死、半致死，故传统方法所利用的形态标记只能代表极少数的基因位点，而且这些位点都是多态的

3、，换言之，利用表型性状检测出的基因位点十分有限，而且这些位点都是可变的(多态的)，因此无法知道基因组中不变位点的比例，也就无法客观地度量遗传变异的大小。由于天然居群中，单基因性状很少，用其作为遗传标记来研究遗传多样性主要还是针对一些具有重要经济价值的农作物、林木和园艺作物及其野生近缘种等，而且多利用这类单基因标记来研究交配系统、基因流和选择等进化因素。相比之下，针对数量性状的研究则由来己久，通过对这些数量性状的研究同样能分析居群的遗传变异水平和遗传结构，这类研究己在大量的植物天然居群中开展，并取得了许多有价值的资料。研究的性状包括具有系统学价值的形态性状，也包括与植物适应相关的生理和生活史特性。另一类是根据多基因决定的数量性状(如大多数形态性状、生活史性状)。(如习性、物候、结实量、种子萌发和休眠、生活力等然而，由于这些数量性状既受遗传因素的控制也受环境条件的影响，加上决定这些性状表达的都是一些效果微小、交互作用明显的多基因系统，研究的困难很大。但由于这类表型性状的变异往往具有适应和进化上的意义，对其进行研究不仅能初步了解类群遗传变异的大小，更有助于了解生物适应和进化的方式，机制及其影

4、响因素，因此，不少研究试图从形态学水平上对稀有种和广布种的遗传变异进行对比研究。2、染色体检测染色体是遗传物质的载体，是基因的携带者。与形态学变异不同，染色体变异(畸变)必然导致遗传变异的发生，是生物遗传变异的重要来源。除了数目和结构上的变异外，染色体水平上的多样性还可体现在染色体的形态(着丝点位置)、缢痕和随体等核型特征上，这些特征的变异使种内出现细胞型的多样性。随着染色体研究技术的不断发展，如分带技术、细胞原位杂交方法的应用，无疑能在染色体水平上揭示出更多的遗传多样性。显微镜技术的改进，建立了染色体核型和带型分析技术来鉴别宏观物种的分类及核型演化。核型是指把动植物、真菌等的某一个体或某一分类群的体细胞内整套染色体显微摄影后再放大照片，按照染色体相对长度、臂指数、着丝粒指数、染色体臂数等4个参数将所有染色体作系统排列，可代表一个物种的染色体特征，染色体分带技术是将某物种染色体制片，用不同物化手段处理，再用不同染料染色，在荧光激发下染色体臂会显示出不同的带型，如G带，C带，N带等，可明确鉴别许多物种核型中的任一条染色体。此外，染色体结构变异如缺失、易位，非整套染色体变异如缺体、单体、三

5、倍体等都各有其特定的细胞学特征，也可作为一种细胞标记。3、分子检测1）等位酶水平等位酶是由单位点上等位基因编码的同工酶，是借助于特定的遗传分析方法确定的一种特殊的同工酶。由于等位酶谱带同等位基因之间的明确关系，使其成为一种十分有效的遗传标记，是近一二十年来检测遗传多样性应用最普遍的方法，迄今己积累了十分丰富的资料，并在采样原则、实验方法、数据处理和结果分析方面形成了一套统一的标准，尤其是建立了度量遗传变异和居群遗传结构的定量指标，使整个生物界遗传多样性的研究结果可以在共同的基础上进行比较。它具有方便、省时、操作简便、分析简单、易于对比、经齐的优点。经过30多年的发展，与等位酶标记相关的各种电泳、染色、遗传分析和数据处理的统计分析左法也比较成熟。并建立起检测种群遗传分化、遗传多样性和基因流的定量指标，形成了一套统一的标准，这样不同的物种的遗传多样性就可以在同一水平进行比较。现在它已经成为研究遗传多样性、遗传结构、基因流、亲本分析、繁殖方式和交配系统的一种常用的技术。多态位点比例(P)和平均期望杂合度(He)均是衡量遗传多样性水平的指标。前者表示多态位点(有2个以上等位基因的位点)在总位点

6、中所占的比例；后者表示在满足遗传平衡条件下，每个个体带有杂合位点的比例或者在每个位点上呈杂合状态的个体的比例，由次可见，各类生物中的遗传变异水平都能以数值的形式表示出来，这些数据充分说明生物中遗传变异的数量是很高的。以变异水平较低的鸟类为例，其平均多态位点比例为0. 14；平均期望杂合度为0. 042，也就是说，假如鸟类平均有1万个结构基因，则应有1450个基因位点是多态的，平均每个个体大约有420个位点是杂合的，因此每个个体都具有产生2420种不同配子的潜力，由这些配子组合成的基因型种类无疑是个天文数字。这正是自然界无法找到两个遗传基础完全相同个体的原因。从表4还可以看出，无脊椎动物的遗传变异水平比脊推动物高得多，前者多态位点比率(0. 469)接近后者(0.247)的2倍，而平均杂合度则为后者的2倍多(0.134对0. 060)。植物的变异水平也很高，接近无脊椎动物的水平。然而，无论是动物还是植物，遗传变异水平会依类群或物种生物学特性不同而有很人的差别。如同是植物，自花授粉物种与异花授粉物种之间在遗传多样性上平均相差3倍左右等位酶方法不仅能定量地估计遗传变异水平的高低，还可以有效

7、地度量居群的遗传结构，即遗传变异在居群中的分布。了解居群的遗传结构对进化和保护生物学研究尤为重要。因为不同的居群遗传结构是各种进化因素共同作用的结果，决定了物种保护应采取什么样的策略和措施。分布地域广、寿命长、基因交流频繁、结实量高以及处于演替阶段末期群落中的物种具有较高的遗传变异水平，而影响居群遗传结构的最重要因素是繁育系统方式和基因交流程度。2）DNA水平DNA是遗传信息的载体，遗传信息就是DNA的碱基排列顺序。因此，直接对DNA碱基序列的分析和比较是揭示遗传多样性最理想的方法。但是，除了几种模式生物外，要想进行DNA全序列分析在可预见的将来都是不现实的，更不用说基于个体水平上的检测。因此，目前DNA分析技术主要是针对部分DNA进行的。从原理上可大致分为两类:DNA直接测序：分析一些特定基因或DNA片段的核苷酸序列，度量这些片段DNA的变异性; 直接测序是一件费时、费力、经济投入很大的工作，尤其是在被分析的个体数量较大时不太现实；加上目前测序工作主要是针对一些比较保守的DNA片段，如Ribisco大亚基基因、DNA部分片断，序列分析主要应用在动植物系统发育推断和宏观进化研究方面。D

8、NA分子标记：检测基因组的一批识别位点，从而估测基因组的变异性。对特定基因组或DNA片段识别位点的研究则十分普遍。RFLP技术RFLP(restriction fragment length polymorphism，限制性片段长度多态性)技术是第一代分子标记技术，它是用已知酶切位点的限制性内切酶消化待研究的DNA，经过电泳、分离Southerm印迹。然后与来自基因组文库或cDNA文库的探针杂交，最后用放射自显影显色或荧光检测与探针互补的DNA片段。由于每种限制性酶只能识别专一的碱基序列，DNA序列的变化将会导致酶切位点的减少或增加或两个酶切位点距离的变化，并表现沈限制性片段长度的变化，从而揭示DNA多态性。RFLP是显性标记，且灵敏度高，可重复性强，在构件遗传图谱、分子标记辅助育种、分析居群间和居群内的遗传与变异、居群间的基因流以及亲缘关系是强有力的工具。但RFLP也存在可选择的内切酶数目有限、操作复杂、成本高等缺点。AFLP技术Zabeau等1993年发明的AFLP（amplified fragment length polymorphism，扩增片段长度多态性)技术是另一种PCR

9、和RFLP相结合分子标记的技术，其基本思想是对基因组DN A酶切片段的选择性扩增，进行AFI一分析前要把DNA用适合的限制性内切酶消化，然后接上人工合成的双链接头，作为PCR扩增的模板。扩增后用聚丙烯酞胺变性胶凝胶电泳。电泳结果可以通过银染、荧光或放射自显影等方法观察。它的优点是方便、可靠，是一种很好的分子标记技术。在构建遗传图谱、定位克隆基因、检测遗传多样性及居群的遗传结构方面都是很好的研究手段，同时AFLP是一种专利技术，价格昂贵，对操作人员的要求较高。对DNA的纯度和内切酶的质量要求较高，因此它的使用范围还是受到一定的限制。RAPD技术RAPD (random amplified polymorphism，随机扩增多态DNA)是第二代分子标记技术，它是用人工合成的长度为l0个碱基随机序列引物对目的DNA进行PCR扩增，扩增的结果用琼脂凝胶电泳检测的一种分子标记技术。近年来它已经成为一种研究遗传多样性的一种有力的工具。但是RAPD的重复性问题曾经引起了一些讨论:引物的浓度、模板的浓度及纯度、聚合酶以及缓冲系统的种类,Mg的浓度以及扩增程序等问题都可能影响扩增结果。大量的研究结果表明，采用相同的扩增程序和反应体系及相同的PCR仪可以很好地解决这个问题。微卫星标记微卫星是指在真核基因组普遍存在的，以1-5个碱基的重复单位组成的串联重复序列，又称SSR (simple sequence repeat )。微卫星在真核基因组非常丰富，长度可达150bp，每10kbpDNA至少有一个微卫星序列，进行微卫星分析时首先要设计一个对特定微卫星位点的PCR引物，然后用引物扩增相应的微卫星片段后，再在聚丙烯酞胺变性胶上进行电泳分离，经染色或放射自显影后检测PCR产物长度的变化。而引物的设计是最费时的一个步骤，微卫星标记具有选择中性、重复性高及检测位点数多的特点，它在遗传多样性研究中具有巨大的潜力。但对于多数野生植物来说由于遗传背景知道的不多，在引物的构建上难度较大，所以还未得到广泛的应用。二、物种多样性与生态系统多样性的测度物种、群落、和生态系统三者紧密相连，是生命系统构成的不同等级。因而在多样性测度时往往只按测定的范围大

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