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【精品】植物成分分析

来源：花匠小妙招时间：2025-09-13 08:51

实验一、分离鉴定植物组织中的氨基酸目的意义层析分离技术(或称色层分析技术)是一种物理分离技术,是利用混合物中各组分的物理化学性质（如吸附力、分子大小和形状、分子亲和力、分子极性、分配系数等）的差别，使各组分以不同程度分布在两相中，达到分离的目的。

根据层析方法所依据的理化性质的不同，层析技术可分为吸附层析、分配层析、离子交换层析、排阻层析、亲和层析等。

根据固定相支持剂的质地和形状等的不同，层析技术可分为纸层析、薄层层析、薄膜层析、柱层析等。

层析分离技术因其操作简便,不需要很复杂的设备，样品用量可大可小，故既可用于实验室的分离分析，又适用于工业生产中产品的分离制备。

它与光学仪器配合，可组成各种自动化分离分析仪器,进一步显示了层析分离技术的优越性。

在生化技术领域里，层析技术已成为一项最常用的分离分析方法。

此项技术可用于研究物质组成和分离纯化各种成分。

通常用于分离分析氨基酸、核苷酸、糖类、激素、维生素等成分。

其优点是能够分离与分析在组成、结构及性质上极为相似的物质，设备简单，操作容易，样品用量少，结果较准确。

本实验目的在于掌握层析法的一般原理和操作技术，学会氨基酸的鉴定方法。

一、纸层析法（一）原理纸层析是分配层析的一种，即以分配系数的不同，使不同物质在不同相中不同程度地分配，从而达到分离的目的.一种物质在不同的溶剂中具有不同的溶解度。

所谓分配系数就是一种溶质在两种存在于同一系统而相互不溶的溶剂中溶解达到动态平衡时，溶质在两相中的浓度比值，通常用α表示：溶剂中溶质的浓度溶剂中溶质的浓度b a =α各种物质的分配系数在一定条件下是一个常数。

将两种溶剂中的一相用一种支持剂加以固定，称为固定相。

让另一相从这相上流过，称为流动相。

这样，分配系数可表示为:流动相中溶质的浓度固定相中溶质的浓度=α纸层析是以滤纸作支持剂的分配层析。

层析溶剂是选用有机溶剂和水组成的.由于滤纸纤维与水有较强的亲和力，能吸附22％左右的水,而与有机溶剂的亲和力很弱，它可以在纸的毛细管中流动。

因此，以水作固定相，而以与水不相溶的有机溶剂作流动相。

层析时，将滤纸的一端浸入展层剂中,有机溶剂就会连续不断地通过点有样品的原点处，使其中的溶质依据其本身的分配系数不断地在两相间进行分配.分配的过程：一部分溶质随有机相移动离开原点而进入无溶质区，并进行重新分配，即一部分溶质从有机相又进入水相.随着有机相不断向前移动,溶质不断地在两相间进行可逆的分配,不断向前移动.各种物质因其分配系数的不同，在两相间分配的数量就不同，分配系数小的溶质在流动相中分配的数量多，向前移动的速度快；而分配系数大的溶质在固定相中分配的数量多,移动的速度慢。

所以各种溶质在层析的过程中由于移动的速度不同便可以彼此分开.溶质迁移的速度用迁移率表示,符号为f R 。

各种化合物在恒定的条件下，经层析后都有其一定的R值,即在层析图谱中f有一定的位置。

借此可以达到分离和鉴定的目的。

决定R值的因素主要是分配系数,而分配系数受以下因素的影响：f1.物质极性的大小:水的极性很强，一般极性强的物质容易进入水相，非极性的物质易进入有机溶剂中。

如侧链含极性基团的氨基酸易分配在水相中,R值f较小，而侧链含非极性基团的氨基酸易分配在有机相中，R值较大。

f2。

滤纸的质地以及为水饱和的程度:滤纸的质地必须均一,纯净，厚薄适当，具有一定的机械强度,层析前应为水和有机溶剂的蒸汽所饱和。

3。

溶剂的纯度、pH值和含水量：pH值和含水量的改变可使氨基酸和展层剂R值也随之改变。

的极性改变，fR值也改变。

当所有条4.层析的温度和时间:温度改变，使溶剂中有机相含水量改变,fR值小。

件相同时，层析时间短，则f因此,层析过程中对以上影响因素要严格控制.（二）实验材料、仪器与试剂1.实验材料：绿豆芽。

2。

仪器：吹风机、层析缸、培养皿、毛细管、针线、尺子、曲别针、新华1号滤纸等.3。

试剂：（1）标准氨基酸溶液：0。

1%的赖氨酸（Lys）、天冬氨酸（Asp）、天冬酰胺（Asn）、谷氨酸（Glu）、脯氨酸（Pro）、苯丙氨酸(Phe）、缬氨酸（Val）、亮氨酸（Leu)及上述各种氨基酸溶液等体积的混合液。

(2）展层剂及显色剂：按正丁醇:95％乙醇:冰乙酸:水＝4:1：1：2配成展层剂后,再以其配成0。

1％的水合茚三酮试剂.（三)操作步骤1。

点样:取新华1号滤纸一张，于距一端2cm处用铅笔画一道直线，并均匀分出11个点,其中8个点分别点8种标准氨基酸（各点4～5次），1个点点混合氨基酸（7～8次)，2个点点样品(7～8次).样品的点法是掰开绿豆芽下胚轴，挤出一些汁液，用毛细管吸一些点样即可。

2。

层析：取大小合适的层析缸一个，其底部放上直径为10cm左右的培养皿。

向培养皿中加入约1。

5cm深的展层剂，盖严，平衡20min。

将点好样的滤纸卷成筒状，用曲别针或针线缝合固定两点（注意不要使滤纸的两边重叠）.将滤纸点样端朝下，点样面向外放入培养皿中，盖严层析缸，开始层析。

待展层剂前沿到达距上端3cm左右时(约4~5h)，层析停止，取出滤纸,用铅笔画下前沿线.3。

显色：用吹风机热风将滤纸吹干,其上的氨基酸便与展层剂中的显色剂——茚三酮发生颜色反应，显出蓝紫色斑点，其中脯氨酸显黄色。

4。

分析：用铅笔描绘出色斑轮廓，计算各样点的f R 值,依据f R 值及颜色与标准氨基酸比较，鉴定出各样点的氨基酸名称,并得出绿豆芽中所含游离氨基酸的种类。

二、薄层层析法（一)原理薄层层析是将吸附剂或者支持剂（有时加入固化剂）均匀地铺在一块玻璃上，形成薄层。

把欲分离的样品点在薄层上，然后用适宜的溶剂展开，使混合物得以分离的方法.由于层析在薄层上进行故而得名.是一种微量、快速的层析方法.它不仅可以用于纯物质的鉴定，也可用于混合物的分离、提纯及含量的测定。

还可以通过薄层层析来摸索和确定柱层析时的洗脱条件。

薄层层析的作用机理主要包括吸附、分配、离子交换和凝胶过滤等作用。

当样品组分在薄板上进行分离时，这几种作用产生不同的影响，究竟哪种作用为主，须视情况而定。

在吸附薄层层析中，因样品组分极性有差异，故不同组分与吸附剂和展层剂的亲和力就有差别，从而导致各组分在薄板上的移动距离不同，组分与吸附剂亲和力强的留在接近原点的位置；反之，组分与吸附剂亲和力弱的留在离原点较远的位置，即亲和力愈弱，移动愈远,于是样品中各组分就得到分离.按照相似溶解相似规律，极性组分易溶于极性溶剂中；非极性组分则易溶于非极性溶剂中,因此在同一薄板上,不同极性化合物的组分在同一溶剂中的溶解度不同,溶解度愈大，移动的速度愈快；否则反之。

展层的过程即样品各组分得到分离的过程,它也是一个吸附，解析，再吸附,再解析的连续过程.同一种物质具有相同的Rf值,不同物质有不同的Rf值，因而达到彼此被分离的目的。

然后用茚三酮显色,与标准氨基酸进行对比，就可以鉴定样品中各种氨基酸的种类，从显色斑点颜色的深浅和大小可以确定氨基酸的含量.（二）实验材料、仪器与试剂1。

实验材料：绿豆芽.2。

仪器：薄层涂布器、研钵、试管、烘箱、真空干燥器、微量注射器、玻璃缸、喷雾器等。

3。

试剂：(1）展开剂Ⅰ：甲酸：叔丁醇：甲乙酮：氨水:水(5：3：1：1,V／V）。

（2)展开剂Ⅱ：异丙醇：甲酸：水（20:1：5，V／V）。

注意：以上两种展开剂临用时配。

(3)0．5％茚三酮丙酮溶液.（4）羧甲基纤维素或微晶纤维素。

（5）标准氨基酸（2mg／mL）。

(三）操作步骤（1）薄层板制备:称取10g微晶纤维素，加入20mL蒸馏水和2。

5mL丙酮，研磨1min，用薄层涂布器涂布于干净的玻璃板上.其厚度以300~500μm为适（比一般薄板厚一些)，凉干后即可使用.(2)样品液制备：称取样品5mg，放入小试管中，加入5。

7N盐酸（恒沸点盐酸）0.6mL。

在火焰上熔融封口后，置于110℃烘箱中水解24h.取出,打开封口于真空干燥器中减压抽干,以去掉过多的盐酸，以稀氨水调节至Ph7左右，加入10％异丙醇最后达0。

5mL，置于冰箱中备用。

（3)点样:用微量注射器取样液5μlspl,滴加在距薄板下边2cm处,点样直径在2～3mm 内为宜。

（4）展开:将已点样的薄板，放入有展开剂Ⅰ的玻璃缸里，先进行碱向展开，当溶剂前沿到达10cm时（约60～80min），将薄板取出，冷风吹干。

再进行酸向展开，将薄板放入有展开剂Ⅱ的玻璃缸中，展开至距离原点10cm时，取出吹于.（5)显色；以0。

5％茚三酮液喷雾于薄层板上,喷得薄板湿润并无液滴流下。

将薄板吹干，有氨基酸的地方显出蓝紫色斑点，只有脯氨酸为黄色斑点。

用笔将斑点圈出或用描图纸复绘保存。

（6）标准氨基酸按上述步骤进行点样，展开显色。

各种氨基酸层析图谱【附注】1.点样时样点不要过大，直径以不超过5mm为宜，最好掌握在2～3mm.每点一次，要等其干后再点下一次（可用吹风机吹干）,以防样点直径过大。

2.毛细管不要乱用，以防将标样弄混。

3。

手要洗凈，并注意拿着滤纸的上端，以防将纸面污染。

4。

吹干时时间不宜过长，以免将样点吹糊。

5.为了定量还可以点上不同浓度的氨基酸标准液，供比较和确定样品中氨基酸的含量.计算：氨基酸含量（mg／kg)=［定容体积(mL)/样品(g）］×［相当标准氨基酸( g）/滴样(mL）]实验二蛋白质含量的测定目的意义蛋白质不仅是植物的结构物质（如生物膜），而且是植物的生理活性物质（如酶），同时也是植物的重要贮藏物质，是维持植物生命活动所必需的。

测定植物组织中及籽粒中蛋白质的含量，对于了解植物体中蛋白质代谢状况和农作物品种的品质有重要意义。

本实验目的是学习测定蛋白质含量的原理和方法.一、改良双缩脲法（一）原理本法是延用已久的蛋白质含量快速测定法，常用于谷物蛋白质含量的测定.双缩脲(NH2—CO—NH—CO—NH2)在碱性溶液中能与Cu2＋产生紫红色的络合物,这一反应称为“双缩脲反应”.蛋白质分子中的肽键也能与Cu2＋发生双缩脲反应，即Cu2＋与肽键中失去氢原子的氮原子相结合而生成紫红色络合物（在550nm处有一吸收峰)，其颜色深浅在一定范围内与蛋白质含量成正相关，而与蛋白质的分子量及氨基酸组成无关，且络合物的颜色相当稳定。

(二）实验材料、仪器与试剂1.实验材料：谷物与豆类种子经风干、磨碎并过100目筛。

2。

仪器：分光光度计、恒温箱、康氏振荡器、离心机、天平、移液管、具塞三角瓶等。

3.试剂：（1）50mmol·L—1KOH溶液（2）双缩脲试剂：量取蒸馏水920mL,加10mol·L-1KOH溶液10mL和25％酒石酸钾钠20mL，摇匀后在剧烈搅拌下加4％CuSO4溶液50mL,密封保存。

如有沉淀析出，则需重新配制.（3)蛋白质标准溶液：精确称取70℃下恒重的纯酪蛋白或牛血清白蛋白1。