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双酶体系催化香叶醇生成R型或S型香茅醛的串联反应

来源：花匠小妙招时间：2025-05-29 02:38

导语

可散发出强烈的柠檬、香茅、玫瑰香味的无环萜类化合物香茅醛，是一种在香精和香料行业非常有价值的分子，也是工业合成(−)-薄荷醇的最重要的前体。(−)-薄荷醇是最具有商业价值的手性化合物之一，也是最畅销的香料之一。在薄荷醇的8种立体异构体中，只有(−)-薄荷醇具有特有的“清凉”效果和薄荷味。化学合成(−)-薄荷醇的路线目前工业上有三条主要，其中两条都是以R-香茅醛为中间体。

研究现状

为了改善工艺的可持续性，并提供替代原料，减轻对石化或不稳定的自然资源的依赖，R-香茅醛可以通过生物催化的方法得到，其中以廉价的非手性底物为原料的替代途径尤其受到人们的追捧。理想的生物催化途径是从现有的柠檬醛出发，以生产R-香茅醛。这种还原反应可以用老黄酶（OYE；EC 1.6.99.1）家族的包含黄素单核苷酸（flavin mononucleotide，FMN）的烯烃还原酶来实现。OYEs普遍存在于细菌、真菌、植物、蓝藻和水藻类中，可以催化多种α,β-不饱和化合物的不对称还原反应。然而，这种生物催化途径仍然具有挑战性，因为柠檬醛是具有两种异构体（E-异构体香叶醛和或Z-异构体橙花醛）的混合物，异构体对OYEs的对映选择性造成了很大影响。目前为止，没有OYEs可以实现柠檬醛的高效转化，以高于95%的对映选择性生成R-香茅醛，这是因为酶催化反应被柠檬醛异构体所抑制。尽管已有多个课题组进行酶工程尝试，但是只有OYE2p可以88.8%的ee值催化柠檬醛混合物（E/Z=10:9）。为了避免通过蒸馏分离柠檬醛异构体过程中较高的能耗及防止异构化，一种直接的方法是原位为OYE提供适当的E-异构体（即香叶醛）。

近日，法国艾克斯-马赛大学Mickael Lafond课题组和荷兰代尔夫特理工大学Caroline E. Paul课题组合作报道了双酶体系（铜自由基醇氧化酶和老黄酶）催化香叶醇生成R型或S型香茅醛的串联反应。铜自由基氧化酶亚家族（CROs），即CRO-AlcOx，是最近从真菌CROs家族中发现的有机无辅因子酶。到目前为止，CRO-AlcOx尚未被应用在多步酶促反应中，而醇的氧化是许多有价值化学品合成路线中的关键步骤。尽管OYEs已经被发现了几十年，但直到最近才在少量串联反应中使用。因此，将这两种酶系统地结合在一起，可以了解它们在更复杂环境中的应用潜力，并探索它们在生物技术应用领域的稳健性和相关性。

研究进展

在本文中，作者将CRO-AlcOx与OYE串联起来以合成R-香茅醛或S-香茅醛。其中CRO-AlcOx可以催化线性香叶醇形成香叶醛，随后OYE催化香叶醛发生氢化反应生成R/S-香茅醛（方案1）。这是第一次利用野生型OYE实现高光学纯度R-香茅醛的制备，同时也是在多酶串联反应中首次使用CRO-AlcOx。

方案1（来源：ACS Catalysis）

CgrAlcOx催化的氧化反应

第一步反应（氧化反应）中涉及的辅酶为过氧化氢酶（CAT，用于原位催化产生H2O2）和辣根过氧化物酶（HRP，用于激活CgrAlcOx），这两个酶都是维持CgrAlcOx活性所必需的。在温和条件下（23 ℃），CgrAlcOx可以将10 mM香叶醇在15 min内完全转化为柠檬醛的一个异构体（图1）。经核磁鉴定发现该异构体为香叶醛。作者发现达到最大的转化率所需的最低辅酶浓度为0.5 μM HRP（图1A）和0.5 μM CAT（图1B）。此外，在15 min内将香叶醇完全转化的CgrAlcOx的浓度为1 μM（图1C）。

图1（来源：ACS Catalysis）

OYE2催化的还原反应

作者随后探究了OYE催化的还原反应以产生R-香茅醛的适宜条件（方案1）。以柠檬醛（商业可得的橙花醛和香叶醛的混合物）为底物进行反应条件的筛选，通过来源于枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）的葡萄糖脱氢酶（BsGDH）参与的NADPH再生系统以确保OYE的氧化还原物质的供应。作者首先检测了来源于酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）的不同浓度OYE2在5 h内对20 mM柠檬醛的影响。结果显示：OYE2的浓度增加导致反应转化率的增加，在5 h内，10.67 μM OYE2催化下的转化率为94.6%，TON 为1,773，TOF 为 0.10 s−1。作者还对6 h内反应的转化率和ee值进行了时间-过程监测（图2），发现当转化率较高时，产物R-香茅醛的ee值降低。这是因为OYE催化香叶醛的还原反应速率大于橙花醛，但随着时间的推移，橙花醛的消耗导致了S-香茅醛的生成，所以ee值降低。此外，相比于0.1和0.5 mM NADP+时的转化率，1 mM和2 mM NADP+时反应转化率更高。

图2（来源：ACS Catalysis）

CgrAlcOx和OYE2催化的串联反应

基于已确定好的各个参数，作者搭建了双酶（CgrAlcOx 和 OYE2）催化的串联反应。CgrAlcOx将香叶醇氧化为香叶醛后，OYE2催化香叶醛发生还原反应，并且在2.5 h内以不小于95%的对映选择性生成R-香茅醛（图3A）。但是，在串联反应中，仍有部分的香叶醇未被氧化（图3A），这可能是因为产生的香茅醛会部分抑制CgrAlcOx的活性。

为了解决CgrAlcOx活性被抑制的问题，作者先将除BsGDH外的试剂加入到反应体系中，反应15 min后，加入BsGDH并继续反应2.5 h。在该条件下，香叶醇完全反应，并且95.1%的中间化合物（香叶醛）以95.9%的对映选择性转化R-香茅醛（图3B）。

此外，作者还搭建了大规模（20 mL）的双酶催化反应体系。底物香叶醇的初始浓度为20 mM（相当于62 mg）。为了保证两步反应都能完全反应，需要将反应体系用纯氧处理以防第一步反应中氧气不足，同时将第一步反应（CgrAlcOx催化的氧化步骤）的时间增加到1 h，并且第二步反应（OYE2催化的烯烃还原步骤）的时间增加到5 h。最后，98%的香叶醇发生反应，并且以72%的产率、95.1% ee值得到了44.3 mg的R-香茅醛。

图3（来源：ACS Catalysis）

总结

作者从便宜的香叶醇出发，采用一锅法双酶催化的串联反应，以不小于95%的对映选择性获得了R-香茅醛，克服了柠檬醛中E/Z-异构体混合物被OYE还原的问题。此外，可以通过将OYE2替换为GluER来生产对映体。这项工作为生产重要香精(-)-薄荷醇的关键中间化合物R-香茅醛提供了一种生物催化方法。

论文信息：

Tunable Production of (R)- or (S)‑Citronellal from Geraniol via a Bienzymatic Cascade Using a Copper Radical Alcohol Oxidase and Old Yellow Enzyme

David Ribeaucourt,⧧ Georg T. Höfler,⧧ Mehdi Yemloul, Bastien Bissaro, Fanny Lambert, Jean-Guy Berrin, Mickael Lafond,* and Caroline E. Paul*

ACS Catalysis DOI: 10.1021/acscatal.1c05334