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【Plant Biotech J】脂肪酸9的自然变异是大豆中脂肪酸和蛋白质含量的决定因素

来源：花匠小妙招时间：2025-05-10 02:07

题目：Natural variation in Fatty Acid 9 is a determinant of fatty acid and protein content

刊名：Plant Biotechnology Journal

作者：Fanjiang Kong, Qingshan Chen et al.

单位：Northeast Agricultural University, Harbin

日期：08 November 2023

摘要

大豆是世界上最重要的经济作物之一，也是人类饮食中不饱和脂肪酸和蛋白质的重要来源。消费者对健康油脂的需求正在增加，预计到2050年，全球对植物油的需求将翻一番。鉴定调节种子脂肪酸含量的关键基因可以促进脂肪酸谱增强的优质大豆品种的分子育种。在这里，我们分析了547份大豆种子脂肪酸含量变异的遗传结构，主要包括来自中国东北的地方品种和品种。通过脂肪酸分析、基因组重新测序、群体基因组学分析和GWAS，我们在FA9基因座上鉴定出一个SEIPIN同源物是种子脂肪酸含量的重要贡献者。转基因和多组学分析证实，FA9是种子脂肪酸含量的关键调节因子，对种子蛋白质和种子大小具有多效性影响。我们在1295份重新测序的大豆材料中鉴定了两种主要的FA9单倍型，并在424份材料的田间种植中评估了它们的表型效应。携带FA9H2的大豆材料的总脂肪酸含量和蛋白质含量显著高于携带FA9H1的大豆材料。FA9H2在野生大豆中不存在，但在13%的地方品种和26%的品种中存在，这表明它可能是在大豆驯化后改良过程中选择的。因此，FA9为具有特定种子贮藏特性的优质大豆品种的分子育种提供了有用的遗传资源。

技术路线

The 547 soybean germplasm accessions 、Genome resequencing and variant detection

Phylogenetic and population structure analyses

Genome-wide association study of seed fatty acid profile

Vector construction and transformation

Measurements of seed fatty acid profile and protein content

Microscopy observations、High-throughput lipidomics profiling and data analysis

Nucleotide diversity and molecular evolution analyses

主要结果

3.1 547份大豆材料的地理分布及遗传变异

我们生成了365个品种和182个地方品种的全基因组重测序数据，其中93.60%来自东北各省（即黑龙江、辽宁、吉林和内蒙古）。NEC共有363个品种和149个地方品种；西北地区2个品种和2个地方品种；来自北美的30种陆地种族；和1个来自日本的栽培品种（图1a）。我们获得了超过210亿个高质量的reads，测序深度为6倍。将所有的数据映射到Glycine max Wm82.a2.v1参考基因组。基因组覆盖率在72.54%至96.35%之间，平均为91.04%，证实了全基因组重测序数据的高质量。

图1 547份大豆材料的群体结构分析。（a） 547份大豆材料的地理分布，包括365个品种（黄色）和182个地方品种（绿色）。A、黑龙江。B、吉林。C、辽宁。D、内蒙古。E、西北地区。还包括来自北美的30个地方品种和来自日本的1个栽培品种。（b）使用来自所有材料的高质量SNPs构建的邻居连接系统发育树。（c）显示K值为2和3的种群结构分析的条形图。（d）主成分分析图显示了所有材料的前两个成分。（e）第1组（红色）、第2组（黑色）和第3组（蓝色）的连锁不平衡（LD）衰减图。

3.2 大豆群体结构、遗传多样性与连锁不平衡

我们使用上述SNPs构建了具有MEGA X的邻居连接系统发育树。根据它们的亲缘关系和结构结果，将这些材料分为三组。第1组由171份材料组成，主要包含地方品种（117个地方品种和54个品种），而第2组混合了几乎相同数量的地方品种和品种（45个地方品种，42个品种）。第3组主要包含栽培大豆（269个品种和20个地方品种）（图1b）。结构分析表明，当K = 2，第1组和第2组的祖先（黄色）是混合的，而第3组的祖先几乎是固定的，这表明第3组可能经历了最高水平的选择。

栽培材料和地方品种之间的显著分离表明，该群体有很高的改良选择水平。当K = 3，更多的遗传变异（蓝色）被引入种群，在第1组中具有更高的多样性（图1c）。这里确定的三个组与另一项对250个品种和地方品种的研究中确定的组相似，尽管后一项研究包含了一个额外的欧洲组。同样，主成分分析（PCA）显示，第1组和第2组样本分散，但倾向于向中心聚集，这表明从第1组、第2组到第3组的遗传多样性减少（图1d）。相比之下，第3组的聚类更紧密，这支持了这样一种观点，即该组的遗传多样性较少，可能经历了更多的选择。我们在第1组中观察到最小的连锁不平衡（LD，用R2表示）衰减距离，其次是第2组和第3组（图1e）。从第1组到第3组LD衰变距离的增加与这些组中遗传多样性的减少一致。品种的LD衰变距离也大于地方品种，这与从地方品种到品种改良过程中遗传多样性的减少一致。

3.3 与脂肪酸含量相关基因座脂肪酸9的GWAS鉴定

为了深入了解大豆种子脂肪酸图谱的遗传变异，我们使用两年的表型数据对种子脂肪酸谱进行了GWAS，包括547份重新测序的材料中的总脂肪酸含量和棕榈酸、硬脂酸、油酸、亚油酸和α-亚麻酸的含量。所有测试的性状在两年之间都显示出显著的相关性（P<0.001），变异系数（CV）在10.59到31.51之间。总体而言，与种子脂肪酸图谱相关的所有性状在测试材料中都表现出丰富的变异。

三个表型数据集（2018、2019和BLUP）和4 252 093个SNPs（MAF> 0.05）用于利用全基因组有效混合模型关联（GEMMA）软件进行GWAS分析。我们使用了P的显著性阈值< 5.38 × 10−8来鉴定与至少一个表型数据集中的六个脂肪酸相关性状中的至少一个显著相关的SNPs。

为了简单起见，在PLINK软件中实现了SNP聚集程序，并将具有其周围500kb区域的峰值SNP定义为显著相关的基因座。在9号染色体上发现了总脂肪酸BLUP的显著位点/峰值SNP（chr9:47115317，C至T，P = 9.94 × 10−11）（图2a，b），因此我们将该位点命名为脂肪酸9（FA9）。FA9基因座也位于大豆籽油含量的元QTL区域，该区域与之前发表的五个QTL重叠。FA9基因座位于具有强LD（平均r2= 0.70）（图2c），其包含八个基因（表S5）。显著的SNP峰位于Glyma09G250400的第一个外显子，该外显子编码一种假定的脂肪调节蛋白。Glyma09G250400是拟南芥AtSEIPIN1（AT5G16460）的直系同源物，已知其影响三酰甘油的积累和脂滴增殖。该区块中的其他基因被注释为参与防御反应，因此我们认为Glyma09G250400是FA9基因座的有力候选基因，并参照其拟南芥同源物将其命名为GmSEIPIN1A。FA9在整个种子发育过程中表现出比LD块中的其他基因更高的表达（图2d），并在大豆的多个组织中表达。其表达在种子发育的中后期最高，在茎中表现出中等表达，在花和早期荚中表现出较低表达（图2e）。

亚细胞定位分析显示，FA9蛋白定位于内质网，与其在内质网脂质生物合成中的假定作用一致。接下来，我们提取Glyma09G250400的2kb上游和编码区用于单倍型分析。在该区域，7个SNP被分为3个单倍型，GWAS结果的峰值SNP是Glyma.09G250400第一个外显子中的非同义SNP，其在氨基酸14处引起脯氨酸到丝氨酸的转换（图2f）。这种氨基酸转化是两种单倍型之间FA9蛋白结构差异的原因，因此可能具有功能性后果。547份重新测序材料的脂肪酸含量评估显示，携带T等位基因的单倍型FA9H2的总脂肪酸含量高于其他两种单倍型。因此，在FA9蛋白的14位将脯氨酸转化为丝氨酸可能会增加大豆种子中的脂肪酸积累（图2g）。

接下来，我们在拟南芥中过表达FA9H1和FA9H2以证实它们的功能。过表达FA9H2的转基因植物的总脂肪酸含量显著高于过表达FA9 H1的转基因植物（图2h），这与群体遗传分析的结果一致（图2g），并进一步证实了FA9中脯氨酸向丝氨酸的转化可能会增加大豆种子中的脂肪酸积累。FA9H2中棕榈酸、油酸和亚麻酸的含量也显著高于野生型，而FA9H1中硬脂酸和亚油酸的含量显著低于野生型。因此，我们得出结论，GmSEIPIN1A是FA9基因座中与种子脂肪酸含量调控相关的主要候选基因。

图2: GWAS对547份材料的含油量进行了测定。（a）使用最佳线性无偏预测（BLUP）绘制的曼哈顿含油量图。（b）、基因定位图（c，顶部）和连锁不平衡图（c，底部）。（d）连锁不平衡区候选基因的基因表达热图。（e） Glyma09G250400在不同组织中的表达模式。（f） FA9启动子（2kb）和基因区的单倍型检测：三种主要单倍型分别命名为FA9H1（浅绿色）、FA9H2（浅蓝色）和FA9H3（灰色）P’表示脯氨酸，S’表示丝氨酸。（g）使用BLUP比较三种单倍型的总脂肪酸含量（h） WT（Col-0）、FA9H1-OE和FA9H2-OE拟南芥植物中总脂肪酸含量的统计分析。

3.4 FA9控制种子脂肪酸含量，并对种子相关性状具有额外的多效性作用

为了进一步证实FA9在大豆种子脂肪酸含量中的作用，我们使用CRISPR-Cas9系统产生了FA9敲除突变体。获得了两个敲除等位基因（fa9-KO-1和fa9-KO-2）：fa9-KO1型在CDS的272碱基处有一个碱基插入，导致在125氨基酸处过早终止，而fa9-KO2型在CDS中的269–272碱基处缺失了4个碱基，导致在93氨基酸处发生移框突变和过早终止。

敲除FA9显著降低了大豆种子中的含油量积累（图3a），进一步证实了FA9在脂肪酸生物合成和积累中的重要作用。正如预期的那样，fa9 KO品系中棕榈酸和油酸的含量显著增加，而亚油酸的含量和油含量显著降低（图3c）。有趣的是，fa9 KO系种子中的蛋白质含量显著高于对照种子（图3b），反映了通常观察到的蛋白质和脂肪酸含量之间的负相关性。

接下来，我们通过透射电子显微镜观察了不同发育阶段的大豆种子，发现在种子发育的早期（EM阶段），脂滴和储存蛋白尚未开始形成。在种子发育中期（MM期），突变体种子中的脂滴明显少于野生型种子；fa9 KO种子中的蛋白质储存液泡明显更丰富，尽管储存蛋白质尚未开始形成。在种子发育后期（LM期），突变种子中的脂滴再次显著减少；在细胞壁周围仅可见少量脂滴。相比之下，突变体种子中完整的蛋白质储存液泡明显更丰富，几乎填满了整个细胞体积（图3d）。所有这些结果进一步表明，FA9是种子脂肪酸谱的关键调节因子。

fa9突变对大豆农艺性状也有多效性影响。在田间实验中，fa9 KO系表现出种子大小的变化，主要反映在更大的种子长度和种子宽度上（图3e–h）。节点数、单株种子重量和其他与产量相关的性状在fa9 KO品系和WT之间没有显著差异。因此，fa9 KO品系产生了更大的种子。

总之，这些结果表明，FA9功能的丧失降低了亚油酸和油含量，显著增加了油酸含量，还增加了种子大小和蛋白质含量。

图3 FA9基因敲除对种子脂肪酸和蛋白质含量影响的功能验证。（a–c）DN50和fa9-KO转基因植物的（a）油含量、（b）蛋白质含量和（c）脂肪酸成分的统计分析。（d） DN50和fa9-KO转基因植物种子在四个种子发育阶段（早熟（EM）、中熟（MM）、晚熟（LM）和DS）的脂滴和蛋白体（PBs）。（e，f）DN50和fa9-KO转基因植物的（e）种子长度和（f）种子宽度的比较。（g） DN50和KO品系种子长度的统计分析。（h） DN50和KO品系种子宽度的统计分析。

3.5 多组学分析表明，FA9是种子脂肪酸分布的关键调节因子

我们在MM、LM和干种子（DS）阶段鉴定了DN50（WT）和fa9（KO-A型）植物种子之间的差异表达基因（DEGs）（表S6）。在MM、LM和DS阶段，总共分别鉴定出2144个、3280个和2607个DEG。对每个阶段的DEG进行GO和KEGG富集分析，揭示MM阶段脂肪酸降解和亚油酸代谢的富集，LM阶段的α-亚麻酸代谢、亚油酸代谢和醚脂代谢，以及脂肪酸降解、TCA循环，以及DS阶段的脂肪酸生物合成。

接下来，使用LC–MS和GC–MS平台对MM至DS阶段的样本进行非靶向脂质组学分析。总共鉴定了854种脂质、44种、64种和48种，其中在特定阶段，WT和fa9 KO种子之间的脂质代谢产物（DAM）含量不同。在MM阶段，KO中的二酰基甘油（DAG）和磷脂酸（PA）水平高于WT种子，但三酰基甘油（TAG）、磷脂酰胆碱（PC）、磷脂酰基甘油（PG）和鞘脂（包括神经酰胺和葡糖基神经酰胺）水平较低。在LM阶段，KO中的DAG、磷脂酰乙醇胺（PE）和神经酰胺（Cer（t-））水平高于WT种子，但TAG、PC和PA水平较低。在DS阶段，KO中的DAG和Cer（t-）水平高于WT种子，但TAG、PC、PE、PG和葡糖基神经酰胺（GlcCr（d-））水平较低。总体而言，从MM阶段开始，KO种子中的DAG含量较高，TAG和PC含量较低，这是一个显著的趋势。在DS阶段，KO种子中除PA外的所有磷脂别都较低。

还进行了蛋白质组学分析，在WT和fa9 KO种子中鉴定出308种独特肽和5570种蛋白质。在MM、LM和DS阶段，总共分别鉴定出683、289和571种差异丰富的蛋白质（DAP）。对每个阶段的DAP进行GO和KEGG富集分析，揭示MM阶段不饱和脂肪酸生物合成和α-亚麻酸代谢的富集，LM阶段光合生物中的氨基糖和核苷酸糖代谢和碳固定，以及DS阶段的鞘糖脂生物合成。

为了更深入地了解参与大豆油合成和积累的关键基因，我们基于KEGG富集对转录组、蛋白质组和脂质组数据进行了全面的综合分析。在MM、LM和DS阶段，在KO突变体和WT种子之间共鉴定出32个DEG、13个DAP和28个DAM。它们参与的途径以及它们在fa9 KO突变体中的表达/丰度变化如图4所示。

ACC1（Glyma.06G105900）编码乙酰辅酶a羧化酶，该酶催化质体中乙酰辅酶a形成丙二酰辅酶a，这是碳转化为脂肪酸的关键初始步骤。在LM阶段，KO突变体中的ACC1表达低于WT（|log2FC|= 1.04，P< 0.05），并且PE含量（16:0/18:1）在突变体中更高（|log2FC|= 1.21，P< 0.05）。与这一结果一致，先前的研究表明，TAG在Acc1突变体种子中的积累减少，导致C18:1脂肪酸的富集（图4）。FATB在饱和脂肪酸合成中具有重要作用，催化ACP释放16:0和18:0脂肪酸。两个FATB基因在DS期的KO系中表现出降低的表达：Glyma.06G211300（|log2FC|= 1.18，P< 0.05）和Glyma.20G122900（|log2FC|= 1.78，P< 0.05）。同样，与FATB活性相关的9种脂质代谢产物，包括PC和PE，在DS阶段的含量明显较低（图4）。

长链酰基辅酶A合成酶（LACS）将从头脂肪酸合成产生的游离长链脂肪酸（LCFA，13-21个碳）酯化，生成脂肪酰基辅酶A硫酯。此处，LACS2（Glyma.12G047400）上调，DG含量（16:0/18:3/0:0）较高（图4，质体部分）。这些结果表明，fa9 KO突变体种子的质体中的从头脂肪酸合成较低，尤其是在LM和DS阶段。

编码磷脂酸磷酸酶（PAP）的三个PAH基因在三个发育阶段有差异表达。PAP催化磷脂酸的去磷酸化，从而为ER中TAG的合成提供DAG。一个PAH2基因（Glyma.17G242900）在MM期上调，但随后强烈下调（|log2FC|= 1.43，P< 0.05）。另一个PAH2基因（Glyma.04G038200）在LM下调（|log2FC|= 1.15，P< 0.05），并且PAH1基因（Glyma.13G134500）在DS下调（|log2FC|= 1.24，P< 0.05）。对应于这三个PAH基因的DAM包括10个甘油脂质和1个鞘脂，所有这些都在LM和DS阶段显示出显著的下调（图4）。这些结果表明，与WT相比，在fa9 KO突变体的LM和DS阶段，ER DAG池的大小可能已经减小。

TAG生物合成的最后一步是DAG的酯化，这可以通过DGAT催化的酰基CoA依赖性途径或PDAT催化的酰CoA非依赖性途径实现（Torabi等人，2021）。两个GmDGAT2D同源物和一个推定的PDAT2同源物在KO和WT种子之间差异表达。第一个GmDGAT2D同源物（Glyma.09G195400）在LM阶段在KO种子中下调（|log2FC|= 1.13，P< 0.05），而第二个（Glyma.16G115700）上调（|log2FC|= 1.10，P< 相关的DAM包括DAG（18:1/18:2/0:0），其在LM阶段更丰富（|log2FC|= 0.96，P< 0.05），以及PC（16:0/18:2）、PC（18:3/18:2），PE（18:3/18:2）和PE（16:0/18:2），它们被强烈下调。PDAT2同源物Glyma.12G084000在突变体中在LM阶段下调（|log2FC|= 1.78，P < 0.05），PC（10:0/24:4）含量较低（|log2FC|=2.08，P< 0.05）。总体而言，对DAM的分析表明，在LM阶段，KO中的DAG含量高于WT种子，TAG含量低于WT种子。这些效应可能主要归因于GmDGAT2D和PDAT2的下调，这两种药物都利用DAG产生TAG（图4）。这些结果还表明，在fa9 KO突变体中，DAG库显著较小，包括DAG（18:1/18:2/0:0）、PC（16:0/18:2）、PC、PE（18:3/18:2）和PE（16:0/18:2）。

合成的TAG在球形脂滴中积累，其生物发生涉及油蛋白结构蛋白的活性。在这里，在综合转录组学和蛋白质组学分析中鉴定了8个油蛋白的DAP，其中3个（A0A0R0EDR0、C6SZ13和A0A0R0JP17）也在综合转录、蛋白质组学和脂质组分析中鉴定。在LM和DS阶段，所有8种DAP在KO突变体中显著下调，特别是A0A0R0EDR0、C6SZ13和A0A0R0JP17，并且9种甘油的丰度相应降低（图4）。这些结果表明，在fa9 KO突变体中，用于种子储存的脂肪酸较少，尤其是在DS阶段。

过氧化物酶体中参与脂肪酸β氧化的许多基因/蛋白质在KO突变体种子中也显示出表达/丰度的变化。其中包括ACAA1（Glyma.20G009100）及其编码的蛋白3-酮酰基-CoA硫解酶（Q6TXD0），以及Glyma.09G191700及其编码的蛋白质3-羟基酰基-CoA脱氢酶（I1L4J2），所有这些都在突变种子的DS阶段上调（图4）。这些结果表明，fa9 KO突变种子的过氧化物酶体中可能有更大的脂肪酸降解能力。

在联合转录组和蛋白质组分析中，还鉴定了与油酸组成相关的关键基因。

总体而言，综合多组学分析的结果与表型数据一致：两者都表明，在整个发育过程中，KO突变种子的脂肪酸含量低于WT种子，但在DS阶段，油酸含量较高，这可能与较高水平的脂肪酸降解有关。

图4 转录组学、脂质组学和蛋白质组学数据的整合揭示了FA9影响种子脂肪酸含量的调控网络的各个方面。

3.6 一种优良FA9单倍型的鉴定

在证明了FA9在大豆油和蛋白质含量中的作用后，我们接下来使用1295份先前重新测序的材料分析了FA9基因组区域的核苷酸多态性：147份野生材料、574份地方品种和574个品种。我们鉴定了FA9的五种独特变异，并将其分为五种单倍型，其中FA9H1和FA9H2是主要的单倍型（图5a）。FA9H1和FA9H2与547份大豆材料中鉴定的单倍型一致。为了评估两种主要单倍型的表型效应，我们将2018年在合肥（31°N）种植的424份大豆材料的含油量与FA9H1和FA9H2进行了关联。携带FA9H2的大豆材料的含油量显著高于携带FA9H1的大豆材料。有趣的是，FA9H2不存在于野生大豆中，但存在于13%的地方品种和26%的品种中，这表明FA9可能是在大豆驯化后改良过程中选择的（图5b）。由于野生材料中没有FA9H2等位基因，因此在中国地方品种和栽培品种的一个子集中检查了两个主要等位基因的地理分布（图5c）。FA9H2等位基因的频率在中国南方为11%，但在黄淮地区上升到18%，在东北地区上升到37%，表明FA9H2在高纬度地区更常见。这一结果与东北大豆的含油量较高和南方大豆的蛋白质含量较高相一致。然后，我们估计了9号染色体上47.114–47.118 Mb的核苷酸多样性（π），其中包括FA9基因，并发现从野生大豆到地方品种和栽培品种，核苷酸多样性有所减少。在我们的加入小组中，FA9地区的Tajima D的平均值为负值（图5d）。这些结果表明，FA9可能是在大豆改良过程中选择的，导致其在地方品种和品种中快速积累。

我们发现FA9H2等位基因已经在大豆育种中得到应用。我们选择了在中国东北广泛种植的20个大豆品种，发现携带FA9H2等位基因的10个品种的总脂肪酸含量显著高于携带FA9H1的品种（图5e）。基于我们的数据，我们提出了一个模型，描述了两种主要FA9单倍型的选择如何影响不同地区大豆的种子脂肪酸谱（图5f）。

图5 FA9单倍型的地理分化及其对大豆种子脂肪酸含量的影响。（a） FA9。（b） FA9H1和FA9H2等位基因在中国的地理分布。（c）大豆野生材料、地方品种和品种中FA9H1和FA9H2等位基因的分布。（d）对FA9周围区域的d和π统计。（e）携带FA9H2和FA9H1的大豆品种的脂肪酸谱。（f）提出了两种FA9单倍型的分布如何影响不同地区大豆种子贮藏特性的模型。

结论