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一个与栽培花生青枯病抗性紧密连锁的分子标记及应用

来源：花匠小妙招时间：2025-05-09 07:31

1.本发明涉及一个与栽培花生青枯病抗性紧密连锁的分子标记及应用，属于分子生物学领域。

背景技术：

2.青枯病是由青枯雷尔氏菌(ralstonia solanacearum)引起的细菌性病害，分布范围遍布全世界。青枯病是一种土传病害，病原体主要通过植物根部的伤口感染植物，并在植物维管束系统中迅速传播，导致地上部分缺水萎蔫。雷尔氏菌能侵染包括茄科、十字花科、禾本科等450多种植物，中国有90多种植物受到侵染，其中花生、番茄、烟草等作物在十多个省都发生病害。花生种植受青枯病影响的耕地达到80万公顷，占全国种植面积的近16％。一些病害区减产10～20％，极端情况下减产达到50
‑
100％。
3.种植抗病品种是青枯病防治最经济环保的方案。花生是自花授粉植物，所以在杂交育种中获得的抗性能够在子代稳定遗传，有利于抗性品种的推广和应用。目前适应不同生态区的抗病品种的育成和应用显著地克服了过去病区种植感病品种时的大面积枯死和绝收的问题，这些抗病品种仍然是中国青枯病疫区的主推品种，仍然具有很高抗性。目前抗病品种选育还是依靠病圃和人工接种鉴定。人工接种菌群较单一，病圃的面积有限，都是抗性育种工作的限制因素。花生基因组的发表和测序技术的发展，让花生育种工作进入了高效分子育种时代。虽然近些年花生开展了青枯病抗性的qtl定位研究，也获得一些抗性标记，为青枯病抗性的研究提供了理论依据，但是依然不能获得理想的分子标记应用于抗青枯病分子标记辅助育种中。
4.竞争性等位基因特异性pcr(kompetitive allele specific pcr，kasp)可在广泛的基因组dna样品中(甚至是一些复杂基因组的dna样品)，对snps和特定位点上的indels进行精准的双等位基因判断。与taqman双色标记探针法、massarray分子量阵列技术、affymetrix snp芯片相比，kasp技术灵活性更高、试剂成本低，同样成本至少获得两倍的数据量。

技术实现要素：

5.针对现有技术的不足，本发明的目的是提供一个与栽培花生青枯病抗性紧密连锁的分子标记及应用。本发明定位到一个能在多个生育期和多年环境中重复的抗性qtl(qbwr_a12)，以qbwr_a12两翼的snp信息开发了kasp引物，获得一个能应用于远杂9102血缘材料和非血缘材料的snp分子标记。
6.为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案是：
7.一个与栽培花生青枯病抗性紧密连锁的分子标记，所述分子标记为qbwr_a12，位于花生第12染色体的4097252bp处，该位点前后100bp的序列为：
8.tcggaactcgactcctagaatgtccttcaccacctcgtacgttacaaatgcgattgctatggacggcaccacctgcaaaacagcaagttgaagaatgttagaatgcaacaagagtaaggccactaaaaggattgtacctcttga
gtatattagatgagactgacctttacagaatttggcaccagacccttgtataatgca；
9.或
10.tcggaactcgactcctagaatgtccttcaccacctcgtacgttacaaatgcgattgctatggacggcaccacctgcaaaacagcaagttgaagaatgttacaatgcaacaagagtaaggccactaaaaggattgtacctcttgagtatattagatgagactgacctttacagaatttggcaccagacccttgtataatgca。
11.一个用于扩增所述的分子标记的kasp引物组合，所述kasp引物组合包括：
12.qbwr_a12l_f1:5’caaaacagcaagttgaagaatgttag 3’，qbwr_a12l_f2:5’caaaacagcaagttgaagaatgttac 3’，qbwr_a12l_com:5’tacaatccttttagtggccttactc 3’。
13.利用所述的分子标记位点来鉴定花生青枯病抗性的方法，包括：
14.(1)提取待鉴定花生样本的dna，通过snpline基因分型平台对待鉴定花生样本的a12.4097252位点进行分型；
15.(2)若a12.4097252位点的分型结果为g:g时，则待鉴定花生样本表现为抗青枯病，存活率≥70％；若a12.4097252位点的分型结果为c:c时，则待鉴定花生样本表现为感青枯病，存活率<70％。
16.所述的分子标记在花生青枯病抗性鉴定中的应用。
17.所述的分子标记在花生抗青枯病分子育种中的应用。
18.本发明有益效果：
19.本发明利用远杂9102和wt09
‑
0023为亲本的重组自交系群体，构建高密度连锁图谱。定位到一个能在多个生育期和多年份重复到的抗性主效qtl(qbwr_a12)，其区间大小只有374.6kb，lod值为32.42
‑
68.02，贡献率为30.7％
‑
45.5％，比已知的其他青枯病抗性qtl的稳定性和贡献率都高。
20.本发明以主效qtl(qbwr_a12)两翼的snp信息开发了kasp引物，获得一个能应用于远杂9102血缘材料和非血缘材料的snp分子标记，该snp标记位于第12染色体的4097252bp处，基于该qtl开发的标记与青枯病抗性的连锁性更紧密。该方法免去了青枯病接种鉴定或病圃鉴定的步骤，只用检测snp基因型就能够快速准确的获得该材料的青枯病抗性信息，且能应用于花生抗青枯病的分子育种中。
附图说明
21.图1远杂9102和wt09
‑
0023重组自交群体遗传连锁图；
22.图2远杂9102和wt09
‑
0023重组自交群体青枯病抗性鉴定结果；
23.图3定位于第12连锁群(染色体)上qtl_wba12的lod值；
24.图4远杂9102衍生系材料的8个snp位点基因分型结果及青枯病抗性分布；
25.图5 317份自然群体材料的8个snp位点基因分型结果及青枯病抗性分布。
具体实施方式
26.以下结合实施例对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。
27.实施例1栽培种花生远杂9102青枯病抗性主效qtl的获得
28.(1)采用简化基因组测序技术对远杂9102和wt09
‑
0023(高感青枯病)的重组自交系群体进行测序，其中两亲本的测序深度大于20
×
，子代材料的测序深度为5
×
。以栽培种
花生基因组信息(arachis hypogaea.cv.tifrunner v1.0)为参考，获得亲本及子代的基因分型数据。两亲本共获得9万多个基因型为纯合的多态性snp。
29.根据远杂9102和wt09
‑
0023的全基因组重测序结果，共设计17个snp位点的kasp引物，通过基因分型平台获得了群体亲本及子代的基因分型数据。过滤掉在所有子代中缺失率超过10％的snp标记，并通过qtl icimapping v4.1软件过滤掉遗传连锁位置近似的snp标记，最后剩余的标记用joinmap5.0软件，构建了一张有20个连锁群的高质量高密度的遗传谱图，上图标记数为5126个，平均遗传距离为0.65cm(如图1所示)。
30.(2)于2016年、2017年和2018年连续三年，将远杂9102和wt09
‑
0023的重组自交家系种植于广西省贺州市花生综合试验站的青枯病病圃，进行抗性表型鉴定。由于病圃面积有限，最多只能鉴定约900个家系，所以2016年和2017年均鉴定了413个家系，2个重复；2018年鉴定了108个家系，2个重复。2016年和2017年的表型数据只包含413个家系，其余家系表型标记为缺失；2018年表型数据包含521个家系，其中413个家系的表型数据为2016和2017年表型数据的平均值，108个家系为2018年表型数据。2018年还鉴定了47个远杂9102衍生系材料的抗性表型，设了3个重复。2019年和2020年鉴定了317个自然群体材料的抗性表型。分别统计苗期、开花期、结实期和收获期自交系材料的表型数据(即病圃种植条件下各家系植株的存活率)，计算各家系的青枯病抗性(存活率≥70％时为抗青枯病、存活率<70％时为感青枯病)。结果如图2所示。
31.(3)利用mapqtl软件对上述所得图谱和表型数据进行qtl分析，发现在四个生育期和3年环境中都定位到了qbwr_a12，即获得一个重复性良好的主效qtl(qbwr_a12)。qbwr_a12位于第12染色体上，区间大小约为374.6kb，lod值为32.42
‑
68.02，贡献率为30.7％
‑
45.5％(如图3所示)。
32.实施例2与青枯病抗性主效qtl紧密连锁的分子标记在远杂9102衍生系和自然群体中的鉴定
33.(1)根据主效qtl(qbwr_a12)左右两翼的snp位置的基因组序列信息开发了8组kasp引物(见表1)，利用snpline基因分型平台(lgc)验证了这些snp位点在远杂9102和wt09
‑
0023的重组自交系中的真实性，其基因分型结果与测序结果一致。
34.表1 kasp引物序列信息
[0035][0036]
(2)挑选47个远杂9102衍生系材料(见表2)和317个自然群体材料(见表3)在广西省贺州市花生综合试验站的青枯病病圃进行了抗性表型鉴定。47个远杂9102衍生系材料为育种中间材料，来自于不同的杂交组合(其系谱信息见表2，第1个材料是远杂9102，剩余47
个是远杂9102的衍生材料)，大部分材料在6代以上。317个自然群体材料为本研究室多年来收集的农家种、国外引进品种、国内育成品种及育种中间材料等，这些材料的植物型有4种，包括密枝亚种的密枝变种(a.hypogaea subsp.hypogaea var.hypogaea，普通型)、密枝亚种的多毛变种(a.hypogaea subsp.hypogaea var.hirsuta，龙生型)、疏枝亚种疏枝变种(a.hypogaea subsp.fastigata var.fastigiata，多粒型)，疏枝亚种普通变种(a.hypogaea subsp.fastigata var.vulgaris，珍珠豆型)。
[0037]
表2 47个远杂9102衍生材料的系谱信息
[0038]
[0039]
[0040][0041]
表3自然群体材料的植物型
[0042]
[0043]
[0044]
[0045]
[0046]
[0047]
[0048]
[0049][0050]
(3)利用上述8组kasp引物在snpline基因分型平台(lgc)上对远杂9102衍生材料和自然群体材料进行基因分型。按snp分型结果将材料分为两组，并对两组的存活率进行检验，结果如图4所示。
[0051]
由图4可知，在远杂9102衍生材料中，5个snp位点(a12.4097252，a12.4471816，a12.4574468，a12.4628249，a12.5049380)与远杂9102基因型相同的衍生系材料都表现为抗青枯病(存活率≥70％)，与远杂9102基因型不同的衍生系材料都表现为感青枯病(存活率<70％)。所以这5个snp位点在47个远杂9102衍生材料中表现为与青枯病抗性完全连锁。为了进一步验证这8个标记在非远杂9102血缘材料中与青枯病抗性的连锁性，本发明挑选了不同植物型的317份自然群体材料(包括农家种、国外引种和国内育成品种)进行分析，结果表明只有一个snp位点(a12.4097252)与青枯病抗性完全连锁(如图5所示)。
[0052]
综合上述远杂9102衍生系和自然群体材料的验证结果，a12.4097252这个snp位点与青枯病抗性完全连锁，其基因型为g:g时，材料表现为抗青枯病(存活率≥70％)；其基因型为c:c时，材料表现为感青枯病(存活率<70％)。
[0053]
其中，分子标记qbwr_a12位于花生第12染色体的4097252bp处，a12.4097252位点前后100bp的序列为：
[0054]
tcggaactcgactcctagaatgtccttcaccacctcgtacgttacaaatgcgattgctatggacggcaccacctgcaaaacagcaagttgaagaatgttagaatgcaacaagagtaaggccactaaaaggattgtacctcttgagtatattagatgagactgacctttacagaatttggcaccagacccttgtataatgca(seq id no.25)；
[0055]
或
[0056]
tcggaactcgactcctagaatgtccttcaccacctcgtacgttacaaatgcgattgctatggacggcaccacctgcaaaacagcaagttgaagaatgttacaatgcaacaagagtaaggccactaaaaggattgtacctcttgagtatattagatgagactgacctttacagaatttggcaccagacccttgtataatgca(seq id no.26)。