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Cloning, prokaryotic expression, and functional validation of flavonoid 3

来源：花匠小妙招时间：2025-05-06 23:58

摘要：类黄酮3-O-糖基转移酶是植物花青素糖苷化的关键酶。为研究杜鹃花3GT基因的功能，本研究从红比利时杜鹃中克隆了一个3GT基因开放阅读框(open reading frame, ORF)命名为Rh3GT，分析、测定并验证了该ORF及其编码蛋白的理化性质、表达水平、酶学功能等生物学特性。结果表明，Rh3GT全长993 bp，编码330个氨基酸；编码蛋白为亲水稳定的弱酸性蛋白，隶属糖基转移酶家族(GT-B型)，PSPG box结构域中第44位为谷氨酰胺(Q)；系统进化分析发现比利时杜鹃Rh3GT与越橘Vc3GT和黑果越橘Vm3GT的亲缘关系最近；Rh3GT在根中几乎不表达，在茎、叶、花中均有表达，且在盛开期花瓣中表达量最高；花瓣瞬时过表达Rh3GT后发现其总花青苷积累也显著增加；Rh3GT重组蛋白在大肠杆菌BL21中成功表达，并以包涵体形式存在，大小约为36 kDa，与理论预测值接近；高效液相色谱检测发现，经过变性纯化和稀释复性后的Rh3GT重组蛋白可催化矢车菊素和UDP-葡萄糖合成矢车菊素3-O-葡萄糖苷，表明表达的蛋白具有3GT活性。本研究为深入探讨杜鹃花花青苷生物合成分子调控机制提供了基础数据，并为潜在的杜鹃花分子育种提供了理论支持。

Cloning, prokaryotic expression, and functional validation of flavonoid 3-O-glycosyltransferase gene (Rh3GT) from Rhododendron hybridum Hort

YAN Yicheng , WU Zehang , JIANG Yuhang , HU Gaoyuan , YANG Yujie , XIE Xiaohong , WU Yueyan , JIA Yonghong

Abstract: Flavonoid 3-O-glucosyltransferase (3GT) is a key enzyme in the glucosidation of anthocyanins. To investigate the 3GT gene in rhododendron, we cloned an open reading frame (ORF) of 3GT gene (named Rh3GT) from Rhododendron hybridum Hort (Red cultivar) and then characterized this gene and the deduced protein in terms of the biochemical characteristics, expression level, and enzymatic function. The results showed that Rh3GT had a full length of 993 bp and encoded 330 amino acid residues. The deduced protein was hydrophilic, stable, weak acid, belonging to the glycosyltransferase family (GT-B type), with glutamine (Q) at position 44 in the PSPG box. The phylogenetic analysis showed that Rh3GT was most closely related to Vc3GT from Vaccinium corymbosum and Vm3GT from Vaccinium myrtillus. Rh3GT was expressed in the stems, leaves, and flowers and almost not expressed in the roots, with the highest expression level in petals during full blooming stage. Introduction of pCAMBIAL1302-Rh3GT into petals significantly up-regulated the expression level of Rh3GT and increased the total anthocyanin accumulation. Rh3GT was successfully expressed in Escherichia coli BL21 in the form of inclusion bodies with a size of about 36 kDa. The results of HPLC showed that the recombinant Rh3GT after denaturation, purification, and dilution could catalyze the synthesis of cyanidin and UDP-glucose to synthesize cyanidin 3-O-glucoside, indicating that the expressed protein had 3GT activity. This study provides basic data for further studying the molecular regulation mechanism of anthocyanin biosynthesis and theoretical support for molecular breeding of rhododendron.

Keywords: Rhododendron hybridum Hort flavonoid 3-O-glycosyltransferase (3GT) expression analysis transient overexpression prokaryotic expression

对于观赏性植物而言，花色是其最重要的性状之一。花色直接影响植物的观赏性和经济价值，因此花色一直是观赏性植物研究的重点。影响花色的因素分为环境因素和内部因素。环境因素主要包括植株生长环境、光照强度和光质类型，甚至是噪音等[1-2]。内部因素则更加复杂，包括细胞结构[3]、液泡内的pH值[4]、色素种类(叶绿素、类胡萝卜素和类黄酮等)及含量[5]。上述因素中，类黄酮化合物花青素(anthocyanidin)是花色研究的重点，也是花朵呈色的直接原因[6]。常见的花青素主要包括矢车菊素(cyanidin)、芍药素(paeonin)、飞燕草素(delphinin)、天竺葵素(pelargonidin)、锦葵素(malvacin)和矮牵牛素(petunidin)[7]。花青素在植物体内不能稳定存在，会发生碳位取代，经过糖苷化形成稳定性较高的单糖、二糖或多糖花青苷(anthocyanins)，最后被转运至细胞液泡中，使植物呈现出不同的颜色[8-10]。

类黄酮3-O-糖基转移酶(flavonoid 3-O- glucosyltransferase, 3GT)是实现植物花青素糖苷化的关键酶。花青素C环上3-OH是最常见的糖基化位点，3GT可将糖基供体转移至花青素的3-OH，催化生成花青素-3-O-糖苷(图 1)。目前研究发现，几乎所有花青苷C环上的3-OH都存在糖基取代[11]，例如矢车菊素能以UDP-葡萄糖(uridine diphosphate glucose, UDP-glucose)为糖基供体，通过3GT体外催化合成矢车菊素3-O-葡萄糖苷(cyanidin-3-O-glucoside)[12-13]。

图 1 3GT催化生成花青素3-O-葡萄糖苷原理图Fig. 1 Schematic diagram of anthocyanidin 3-O-glucoside generation catalyzed by 3GT.

另外，3GT还能显著影响花青苷的积累甚至导致花色改变。例如Sun等[14]将小苍兰(Freesia hybrida)的Fh3GT在矮牵牛(Petunia hybrida)中过表达，增加了主要花青苷合成结构基因的转录以及花青苷的积累，导致转基因矮牵牛的花从白色转变为粉红色；Chen等[15]在蝴蝶兰(Phalaenopsis aphrodite)中沉默PeUFGT3导致红色花朵花青苷含量显著降低，从而导致花朵褪色；Sun等[16]及孙威等[17]从马缨杜鹃(Rhododendron delavayi)中克隆了Rd3GT1和Rd3GT6，并将其在烟草(Nicotiana tabacum)中过表达，促进了烟草花青素水平的提高；另外，Rd3GT1在矮牵牛中过表达也能改变矮牵牛的花色。

比利时杜鹃是重要的园艺花卉植物，其花瓣颜色绚丽多彩，具有很高的观赏价值和经济价值[18]。然而目前尚未见关于比利时杜鹃中3GT的克隆及其对花青苷合成的影响的相关研究。本研究以红比利时杜鹃为材料，利用比利时杜鹃花全长转录本筛选到Rh3GT的基因序列信息，设计引物克隆得到Rh3GT基因的开放阅读框(open reading frame, ORF)全长；研究其编码蛋白的理化性质、保守结构域、结构等特性；利用实时荧光定量聚合酶链式反应(real-time quantitative polymerase chain reaction, RT-qPCR)分析该基因在不同组织中的表达情况；通过瞬时过表达分析其对花青苷生物合成的影响；通过原核表达分析该基因的蛋白表达情况；通过HPLC验证其体外酶活功能，以期为深入探讨Rh3GT的功能提供数据基础，并为杜鹃花色分子植物育种提供理论支持。

1 材料与方法1.1 植物材料

本研究所用材料为5年生健康杜鹃花植株盛开期花瓣、根、茎、叶(图 2)，由浙江万里学院北仑杜鹃合作基地提供(E121°27′40″，N29°58′48″)。采后立即放入液氮中冷冻带回，随后放入–80 ℃条件下储存备用。每个样品均设置3个生物学重复。

图 2 红比利时杜鹃不同组织Fig. 2 Different tissues of Rhododendron hybridum (red cultivar).

1.2 RNA提取与cDNA合成

以红比利时杜鹃盛开期花瓣、根、茎、叶为材料，总RNA提取使用多糖多酚植物总RNA提取试剂盒[天根生化科技(北京)有限公司]。cDNA合成使用NovoScript® Plus All-in-one 1st Strand cDNA Synthesis SuperMix (gDNA Purge) (苏州近岸蛋白科技股份有限公司)，得到的cDNA于–40 ℃保存备用。

1.3 Rh3GT基因的克隆

使用Primer 6软件在线设计Rh3GT基因的上、下游引物Rh3GT-F1和Rh3GT-R1 (表 1)。以红比利时杜鹃花瓣cDNA为模板，使用2×Fast Pfu Master Mix高保真酶进行PCR扩增(50 μL反应体系)，10 µmol/L上、下游引物和50 mg/L cDNA各2 μL，补足ddH2O至50 μL。PCR反应程序为：94 ℃预变性1 min 30 s；94 ℃变性20 s，60 ℃退火20 s，72 ℃延伸1 min，35个循环；72 ℃终延伸5 min。用1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，割胶回收目的条带后，将其与pEASY-Blunt Zero克隆载体连接，经过转化、筛选等实验，最终测序获得基因序列。

表 1 本研究所用引物Table 1 Primers used in this study

Primer name Primer sequences (5′→3′) Rh3GT-F1 ATGGGGGCAGAGGAGATGGGGGTGC Rh3GT-R1 CTAAAGGTTGTACCCTGCTA ACTIN-F CACTGGTGTCATGGTTGGGA ACTIN-R CTCTTCAGGAGCAACACGGA Rh3GT-F2 GTGGCCCGTTCAACTCGATA Rh3GT-R2 GTTCCAAAGCCGATGTACGC Rh3GT-F3 acgggggactcttgaccatggATGGGGGCAGAGGAGATGG Rh3GT-R3 tactagtcagatctaccatggAAGGTTGTACCCTGCTACAATCTCC Rh3GT-F4 aatgggtcgcggatccATGGGGGCAGAGGAGATGG Rh3GT-R4 ggtggtggtgctcgagaagGTTGTACCCTGCTACAATCTCC The lowercase letters represent primer adapters.

1.4 生物信息学分析

蛋白结构域分析借助NCBI-CDD (https://ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)在线分析完成；蛋白基本理化性质预测借助Expasy-ProtParam (https://web.expasy.org/protparam/)完成；蛋白二级结构预测采用SOPMA在线平台(https://npsa.lyon.inserm.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=/NPSA/npsa_sopma.html)分析；蛋白三级结构的预测借助SWISS-MODEL (https://swissmodel.expasy.org)在线平台；多序列比对采用DNAMAN进行分析；系统发育树构建使用MEGA 11完成。

1.5 RT-qPCR测定Rh3GT基因在不同组织中的表达情况

使用NCBI Primer-BLAST (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)设计RT-qPCR引物Rh3GT-F2和Rh3GT-R2 (表 1)。以ACTIN为内参基因[19]，以红比利时杜鹃盛开期花瓣及根、茎、叶的cDNA为模板，使用NovoStart® SYBR qPCR SuperMix Plus试剂盒(苏州近岸蛋白科技股份有限公司)完成RT-qPCR反应，反应体系为35 μL，其中Tip Green qPCR SuperMix 17.5 μL，10 µmol/L上、下游引物及50 ng/μL cDNA各0.7 μL，补齐ddH2O至35 μL。反应程序为：95 ℃预变性5 min；95 ℃变性20 s，60 ℃退火1 min，40个循环。采用2−ΔΔCt法计算基因相对表达量。

1.6 Rh3GT在花瓣中瞬时过表达

用Nco Ⅰ核酸内切酶将pCAMBIA1302质粒进行单酶切回收纯化。使用CE Design设计重组质粒引物Rh3GT-F3和Rh3GT-R3 (表 1)，构建重组质粒pCAMBIA1302-Rh3GT并转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞中，测序正确后将重组质粒pCAMBIA1302-Rh3GT和空载质粒pCAMBIA1302分别转入农杆菌GV3101中，并挑取阳性克隆进行PCR，将正确的阳性菌于LB液体培养基含20 mg/L利福平(rifampicin, Rif)、50 mg/L硫酸卡那霉素(kanamycin, Kan)培养，混浊后离心收菌，用侵染液[10 mmol/L MgCl2，10 mmol/L 2-吗啉乙磺酸(2-morpholinoethanesulfonic acid, MES)，200 mmol/L乙酰丁香酮(acetosyringone, AS)]重悬菌体，并调节OD600至0.6左右。使用针筒将空载和含有目的基因的载体侵染重悬液沿着花脉注射到红比利时杜鹃花花瓣中。遮光处理48 h后采摘花瓣进行总RNA提取，反转录为cDNA进行RT-qPCR相对表达量的测定，使用同一朵花瓣进行总花青苷含量的提取与测定，每个样品设置3次生物学重复。实验设置3个组别，分别为CK (未注射)、空载组和实验组。

1.7 总花青苷的提取与测定

参考Mehrtens等[20]的实验方法，使用液氮研磨0.2 g花瓣样品放入离心管中，加入1 mL 1%的盐酸-甲醇溶液，在室温下摇晃18 h，12 000 r/min离心5 min，取400 μL上清液加入600 μL 1%的盐酸-甲醇溶液，分别测定波长在530 nm和657 nm处的吸光度，总花青苷含量为(A530–0.25×A657)/m。其中m为样品质量，单位为g。

1.8 Rh3GT重组蛋白可溶性验证及诱导条件探索

原核表达载体构建参考蒋宝鑫等[21]的实验方法。用CE Design设计重组质粒引物Rh3GT- F4和Rh3GT-R4 (表 1)。以花瓣cDNA为模板进行PCR扩增。

将重组质粒pET-28a-Rh3GT和空载质粒pET-28a阳性BL21菌落单菌落分别挑取至50 mL含有50 mg/L硫酸卡那霉素的LB液体培养基中，37 ℃、200 r/min条件下扩增。当菌液OD600达到0.6左右时，加入异丙基-β-d-硫代半乳糖苷(isopropyl-β-d-thiogalactopyranoside, IPTG)母液使其终浓度为0.5 mmol/L，在28 ℃、200 r/min条件下过夜诱导。为诱导可溶性蛋白，设计0.01、0.05、0.1、0.3、0.5、1.0 mmol/L IPTG的浓度梯度，分别在20、28、37 ℃条件下以200 r/min的转速过夜诱导。另外尝试在低温、低IPTG浓度、低菌液OD600条件下延长诱导时间实现可溶性蛋白的诱导。具体条件为16 ℃、100 r/min、IPTG浓度为0.01 mmol/L、菌液OD600为0.4，设置诱导时间梯度为12、24、36、48 h。诱导结束后4 ℃、5 000 r/min离心10 min收菌，用3 mL 0.1%磷酸盐缓冲液(phosphate buffer saline, PBS)悬浮沉淀；对沉淀进行超声破碎处理，超声总时长为5 min，工作时间1.5 s，间歇时间6.5 s；将处理好的样品4 ℃、10 000 r/min离心10 min后吸取上清液，用3 mL 0.1% PBS悬浮沉淀。分别收集上清和沉淀，然后取32 μL蛋白样品加入8 μL 5×蛋白上样缓冲液(上海碧云天生物技术股份有限公司)振荡混匀，100 ℃水浴加热10 min，使蛋白变性，冷却至室温后，进行10% SDS-PAGE分析。

1.9 Rh3GT包涵体蛋白纯化及复性

使用His标签蛋白纯化试剂盒(包涵体蛋白) (江苏康为世纪生物科技股份有限公司)对Rh3GT包涵体蛋白进行纯化，随后进行10% SDS-PAGE检测。使用稀释法对纯化产物进行复性，配制含有50 mmol/L Tris-HCl、0.5 mol/L NaCl、2 mmol/L β-巯基乙醇(2-hydroxy-1-ethanethiol)、1 mmol/L谷胱甘肽(glutathione, GSH)、0.2 mmol/L氧化型谷胱甘肽[glutathione (oxidized)]、1 mmol/L CaCl2的稀释复性液，缓慢向纯化产物中加入其2倍体积的稀释复性液，4 ℃冰箱放置24 h后13 000 r/min离心5 min，取上清液完成复性，用Bradford法蛋白浓度测定试剂盒(北京索莱宝科技有限公司)检测蛋白浓度。

1.10 Rh3GT重组蛋白体外酶活检测

体外酶活检测参考徐僡[12]的方法并稍作修改。以UDP-葡萄糖为糖基供体，矢车菊素为受体，验证Rh3GT重组蛋白是否具有体外催化能力。设置灭活的Rh3GT蛋白、矢车菊素、UDP-葡萄糖混合反应作为对照组，复性后的Rh3GT、矢车菊素、UDP-葡萄糖混合反应作为反应组。具体反应体系如下：1 mg/mL UDP-葡萄糖300 μL、2 mg/mL矢车菊素100 μL、复性后或100 ℃水浴加热10 min灭活的Rh3GT重组蛋白100 ng、补充0.1 mol/L的Tris-HCl缓冲液(pH 7.8)至600 μL，30 ℃条件下反应1 h，用100 μL 10%盐酸终止反应，13 000 r/min离心5 min，上清液经过0.22 µm有机相滤膜过滤后转移至上样瓶。使用HPLC对酶促产物进行分析。色谱柱使用ZORBAX Eclipse Plus C18柱，流动相A：0.1%甲酸水溶液，流动相B：100%乙腈，进样量5 μL，流速1 mL/min，柱温35 ℃。采用梯度洗脱：0–1.0 min，5% B；1.0–2.5 min，5%–50% B；2.5–3.8 min，50%–70% B；3.8–5.0 min，70%–90% B；5.0–6.0 min，90% B；6.0–6.2 min，90%–5% B；6.2–8.0 min，5% B。检测波长为530 nm。所用标品均购自上海源叶生物科技有限公司。

2 结果与分析2.1 Rh3GT基因的克隆及氨基酸序列分析

通过特异性引物扩增获得一个新的3GT基因ORF全长，命名为Rh3GT。凝胶电泳显示，该基因PCR产物约为1 000 bp，且条带清晰(图 3A)。通过基因测序发现Rh3GT全长为993 bp，长度与电泳结果基本一致，该基因共编码330个氨基酸(图 3B)。

图 3 Rh3GT PCR扩增产物的凝胶电泳检测和编码氨基酸序列Fig. 3 Gel electrophoresis detection of PCR amplified products of Rh3GT and encoded amino acid sequences. A: Rh3GT electrophoresis diagram. Marker: DL2000 DNA marker. B: The Rh3GT sequences obtained from sequencing and its encoded amino acid sequences. A：Rh3GT凝胶电泳条带图。Marker：DL2000 DNA marker。B：测序所得的Rh3GT序列及其编码氨基酸序列。

2.2 Rh3GT蛋白的理化特性及结构域

使用Expasy-ProtParam分析Rh3GT蛋白的理化性质，结果显示Rh3GT由330个氨基酸组成，相对分子量为36 018.47 Da；理论等电点为6.02；酸性氨基酸数(天冬氨酸+谷氨酸)为34个，碱性氨基酸数(精氨酸+赖氨酸)为39个，总体表现为弱酸蛋白；稳定性系数为38.55，为稳定蛋白质；脂肪族氨基酸指数为91.82；亲水性为0.039，为疏水性蛋白。综上，Rh3GT为弱酸性稳定的疏水性蛋白。

采用NCBI-CDD对Rh3GT蛋白进行功能结构域分析。结果表明该蛋白包含UDP-葡萄糖基转移酶保守域(UDPGT)以及GT1_Gtf-like特殊结构域，属于Glycosyltransferase-GTB-type超基因家族成员(图 4)，为GT-B型糖基转移酶。

图 4 Rh3GT蛋白的保守结构域Fig. 4 Conserved domain of the Rh3GT protein.

2.3 Rh3GT蛋白的多序列比对及系统发育分析

选取黑果越橘(Vaccinium myrtillus)、越橘(Vaccinium corymbosum)、中华猕猴桃(Actinidia chinensis)、佛罗里达山茱萸(Cornus florida)、三七(Panax notoginseng)、半边莲(Lobelia erinus)、洋桔梗(Eustoma grandiflorum)、烟草(Nicotiana tabacum)的3GT同源蛋白与Rh3GT进行多序列比对和系统发育分析。多序列比对发现Rh3GT与另外8条不同物种来源的3GT蛋白之间的相似度介于42.18%和60.39%之间。其中，Rh3GT与烟草Nt3GT相似度最低，为42.18%；与越橘Vc3GT相似度最高，为60.39%。不同物种来源的3GT蛋白均包含一个由44个氨基酸构成的糖基转移酶的保守域PSPG box，该保守序列被认为是结合糖基供体的区域。Rh3GT蛋白PSPG box中第44位氨基酸为谷氨酰胺(Q)，一般认为这种结构优先以UDP-葡萄糖为糖基供体[22] (图 5A)。系统发育树分析结果表明，比利时杜鹃Rh3GT与黑果越橘Vm3GT和越橘Vc3GT的亲缘关系最近(图 5B)。

图 5 比利时杜鹃与其他物种3GT蛋白的序列比对(A)和系统发育分析(B)Fig. 5 Alignment (A) and phylogenetic tree analysis (B) of 3GT protein sequences in Rhododendron hybridum and other species. Vc: Vaccinium corymbosum; Vm: Vaccinium myrtillus; Ac: Actinidia chinensis; Pn: Panax notoginseng; Le: Lobelia erinus; Eg: Eustoma grandiflorum; Cf: Cornus florida; Nt: Nicotiana tabacum. Vc：越橘；Vm：黑果越橘；Ac：中华猕猴桃；Pn：三七；Le：半边莲；Eg：洋桔梗；Cf：佛罗里达山茱萸；Nt：烟草。

2.4 Rh3GT蛋白的二、三级结构预测

二级结构预测显示，有143个氨基酸参与形成无规则卷曲，占总氨基酸的43.33%；140个氨基酸参与形成α-螺旋，占总氨基酸的42.42%；有47个氨基酸参与形成β-折叠，占总氨基酸的14.24%。结果表明，Rh3GT蛋白主要由不规则卷曲、α-螺旋和β-折叠结构组成(图 6A)。

图 6 Rh3GT蛋白的二、三级结构预测Fig. 6 Secondary and tertiary structure prediction of Rh3GT protein. A: Secondary structure prediction of Rh3GT protein. Yellow represents random coil, blue represents alpha helices, and purple represents beta sheets. B: Tertiary structure prediction of Rh3GT protein. Band-like represents the protein backbone, and the chain is the PSPG box domain part. A：Rh3GT蛋白的二级结构预测。黄色代表无规则卷曲，蓝色代表α-螺旋，紫色代表β-折叠。B：Rh3GT蛋白的三级结构预测。带状代表蛋白主链，链状为PSPG box结构域部分。

三级结构预测显示，Rh3GT蛋白三级结构与二级结构预测结果相符，主要由不规则卷曲和α-螺旋构成。其中活性位点PSPG box存在于一个α-螺旋结构内(图 6B)。

2.5 红比利时杜鹃花盛开期花瓣及根、茎和叶中Rh3GT基因的表达量分析

以红比利时杜鹃盛开期花瓣及根、茎、叶的cDNA为模板，ACTIN为内参基因，使用RT-qPCR技术检测Rh3GT基因在比利时杜鹃不同组织中的表达量，结果显示，Rh3GT基因在盛开期花瓣中表达量最高，叶片和茎中其次，在根中几乎不表达(图 7)。

图 7 Rh3GT在红比利时杜鹃不同组织中的表达谱Fig. 7 Expression profile of Rh3GT in different tissues of Rhododendron hybridum (red cultivar). a, b, c, and d indicate significant differences (P < 0.05). a、b、c、d表示差异显著(P < 0.05)。

2.6 Rh3GT在花瓣中的瞬时过表达分析

Rh3GT基因在红比利时杜鹃花瓣中的瞬时过表达结果表明，Rh3GT在CK和经pCAMBIA1302处理后的花瓣中表达量相近，且无明显差异，而瞬时过表达后花瓣中的Rh3GT表达量显著提高(P < 0.05)大约为CK中表达量的3.75倍(图 8A)。此外，CK组与pCAMBIA1302处理后的花瓣组总花青苷含量相近，而Rh3GT基因瞬时过表达后的花瓣总花青苷含量显著提高(P < 0.05)，约为CK组的1.23倍(图 8B)，表明Rh3GT基因的瞬时过表达增加了花瓣中总花青苷的积累。

图 8 瞬时过表达Rh3GT后基因的相对表达量(A)及花瓣总花青苷含量变化(B)Fig. 8 Changes in the relative expression level of the Rh3GT (A) and the total anthocyanin content of petals (B) after transient overexpression of Rh3GT. CK: Not injected; pCAMBIA1302: Injected with blank vector; pCAMBIA1302-Rh3GT: Injected a vector containing the gene of interest; a and b indicate significant differences (P < 0.05). CK：未注射；pCAMBIA1302：注射空载；pCAMBIA1302-Rh3GT：注射含目的基因的载体；a、b表示差异显著(P < 0.05)。

2.7 Rh3GT重组蛋白可溶性分析及最适诱导条件确定

10% SDS-PAGE结果显示，在28 ℃、IPTG浓度0.5 mmol/L条件下过夜诱导出的目的蛋白大小约为36 kDa，与预期大小相近，说明Rh3GT在大肠杆菌BL21中诱导成功(图 9A)，当没有IPTG的存在时，重组质粒无法表达目的蛋白(图 9A)。

图 9 Rh3GT重组蛋白的10% SDS-PAGE分析Fig. 9 Analysis of recombinant Rh3GT protein by 10% SDS-PAGE. A: Identification of the protein of interest; B: Different concentrations of IPTG were set up to induce soluble target proteins at 20 ℃; C: Different concentrations of IPTG were set up to induce soluble target proteins at 28 ℃; D: Different concentrations of IPTG were set up to induce soluble target proteins at 37 ℃; E: Different induction times were set up to induce soluble target proteins at 16 ℃, 0.01 mmol/L IPTG, a starting OD600 value of 0.4, and a rotation speed of 100 r/min. Red box: Rh3GT recombinant protein. M: 250 kDa protein marker; Su: Supernatant; Se: Sediment. A：目的蛋白的鉴定；B：20 ℃条件下设置不同浓度IPTG诱导可溶性目的蛋白；C：28 ℃条件下设置不同浓度IPTG诱导可溶性目的蛋白；D：37 ℃条件下设置不同浓度IPTG诱导可溶性目的蛋白；E：16 ℃低温、0.01 mmol/L低IPTG浓度、0.4低OD600起始值、100 r/min低转速条件下设置不同诱导时间诱导可溶性目的蛋白。红色方框：Rh3GT重组蛋白；M：250 kDa蛋白marker；Su：上清液；Se：沉淀物。

重组质粒转化菌液分别在20、28、37 ℃环境中，并在不同的IPTG浓度下(0.01、0.05、0.1、0.3、0.5、1 mmol/L)过夜诱导。不同温度、IPTG浓度的条件下Rh3GT重组蛋白均以包涵体的形式存在于悬浮沉淀中。20 ℃条件下诱导时，IPTG浓度越高目的蛋白诱导表达量越高；28 ℃和37 ℃诱导时，当IPTG浓度在0.1 mmol/L以上，目的蛋白的诱导表达量随IPTG浓度的升高不再增加。另外，相较于20 ℃和37 ℃，28 ℃诱导条件下杂蛋白的条带更弱(图 9B−9D)。

进一步降低温度至16 ℃，降低起始诱导菌液OD600值至0.4，降低转速至100 r/min，使用0.01 mmol/L的低浓度IPTG诱导并延长诱导时间最多至48 h，以降低蛋白合成速率，延长重组时间使重组蛋白正确折叠，从而形成可溶性蛋白。结果发现目的蛋白不仅表达量低，且仍以包涵体形式存在于悬浮沉淀中(图 9E)。因此28 ℃、0.1 mmol/L IPTG过夜诱导为Rh3GT包涵体蛋白的最适诱导条件。

2.8 Rh3GT包涵体蛋白的变性纯化

由于重组蛋白以包涵体的形式存在于悬浮沉淀，故使用包涵体纯化试剂盒进行蛋白纯化。蛋白变性溶解后，通过镍柱纯化系统，对目的蛋白进行亲和纯化，最后分批次收集洗脱液，进行10% SDS-PAGE分析，选择纯度及相对含量较高的重组蛋白(泳道9−11)用于下一步稀释复性(图 10)。

图 10 纯化后的Rh3GT重组蛋白的10% SDS-PAGE分析Fig. 10 Analysis of purified Rh3GT recombinant protein using 10% SDS-PAGE. Lane M: 250 kDa protein marker; Lanes 1−12 indicates 1−12 received eluents. Lane M：蛋白250 kDa marker；Lane 1−12表示1−12次接收洗脱液。

2.9 Rh3GT重组蛋白的体外酶活分析

各组别在同等条件下反应后发现，加入灭活Rh3GT重组蛋白(无色透明)的对照组，颜色无变化，而加入稀释复性的Rh3GT重组蛋白(无色透明)的反应组颜色变得更趋向于矢车菊素3-O-葡萄糖苷标准品(图 11A)。HPLC测定结果发现，相较于对照组，稀释复性后的Rh3GT重组蛋白能以UDP-葡萄糖和矢车菊素为底物，催化生成矢车菊素3-O-葡萄糖苷(图 11B−11D)，表明Rh3GT重组蛋白具有类黄酮3-O-糖基转移酶的功能特性。

图 11 体外酶活检测结果Fig. 11 In vitro enzyme activity detection results. A: Color comparison of different groups under the same reaction conditions; B: HPLC analysis of cyanidin 3-O-glucoside standard product; C: HPLC analysis of the mixed reaction of inactivated Rh3GT protein, cyanidin, and UDP-glucose; D: HPLC analysis of the mixed reaction of renatured Rh3GT, cyanidin, and UDP-glucose. A：同等反应条件下不同组别颜色对比；B：矢车菊素3-O-葡萄糖苷标准品的HPLC分析；C：灭活的Rh3GT蛋白、矢车菊素、UDP-葡萄糖混合反应后的HPLC分析；D：复性后的Rh3GT、矢车菊素、UDP-葡萄糖混合反应后的HPLC分析。

3 讨论与结论

本研究从红比利时杜鹃中克隆得到一个Rh3GT基因，分析了该基因及其翻译蛋白的理化特性和组织表达差异，探讨了该基因瞬时表达效果与花青苷含量之间的相关性，表达纯化并验证了其蛋白的酶学特性。

保守结构域分析表明，Rh3GT包含UDP-葡萄糖基转移酶保守域(UDPGT)以及GT1_Gtf-like特殊结构域，属于糖基转移酶Glycosyltransferase_ GTB-type超家族成员，为GT-B型糖基转移酶。Rh3GT的C端存在一个由44个氨基酸组成的PSPG box (W-2x-Q-3x-L-5x-G-x-F-2x-H-x-GW- x-S-2x-ES-3x-GVP-4x-P-5x)，是糖基转移酶识别、结合供体分子的保守序列。该结构域第44位氨基酸为谷氨酰胺(Q)，一般认为这种结构优先以UDP-葡萄糖为糖基供体[22]。这与沙棘(Hippophae rhamnoides)[23]、红花(Carthamus tinctorius)[24]、紫玉兰‘红元宝’ (Magnolia liliflora)[25]中的研究结果一致。另一些结构，如红心猕猴桃(Actinidia chinensis) AcUFGT3a的PSPG box结构域第44位氨基酸为组氨酸(H)，其能以UDP-葡萄糖和UDP-半乳糖(UDP-galactose)为糖基供体合成花青苷，但优先以UDP-半乳糖为糖基供体[26]。

利用RT-qPCR对红比利时杜鹃盛开期不同组织中的Rh3GT基因表达量进行分析，发现在茎、叶、花瓣中均有不同程度表达，其中，在花瓣中表达量最高，但在根中几乎不表达，说明Rh3GT的表达具有组织特异性。这与红花[24]、紫玉兰‘红元宝’[25]、滇牡丹(Paeonia delavayi)[27]等观赏性植物中的研究结果相似。在其他有花植物如丹参的研究中发现，SmUF3GT在丹参地上部分的各组织均有表达，其表达丰度与花瓣、叶边缘、茎以及萼片的紫色花青素沉淀相关联，但在根中几乎不表达[28]；黑果枸杞(Lycium ruthenicum)中，LrUFGU1在花中表达量最高，其次是紫果和叶[29]。另外，与观赏性植物和有花植物不同，根为萝卜的主要器官，紫色萝卜(Daucus carota L.)的DcUCGalT1在根中表达，且表达量与花青苷生物合成呈正相关[30]。大量研究表明3GT基因的表达与组织器官着色相关联。在大葱(Allium fistulosum L.)中发现，AfUFGT在叶片中的表达量最高，但是根中的表达量要高于茎，然而大葱的主要类黄酮物质是槲皮素而非花青素[31]。推测各物种的3GT可能存在不同的生物学功能。

瞬时过表达结果表明，Rh3GT基因在红比利时杜鹃花瓣中瞬时过表达导致总花青苷积累的显著增加，这与Wang等[32]报道的MtUGT84A1的在苜蓿(Medicago truncatula)本体中过表达显著提高了花青苷含量一致。Nguyen等[33]将越橘(Vaccinium vitis-idaea) VcUFGT2与猕猴桃(Actinidia melanandra)类黄酮3ʹ, 5ʹ-羟化酶(flavonoid 3ʹ, 5ʹ- hydroxylase, F3ʹ5ʹH)在草莓(Fragaria ananassa)中瞬时表达，提高了蓝色花青苷的积累，这为花色方面植物育种提供了新思路。Rh3GT通过瞬时过表达被证明可增加杜鹃花青苷积累，后续可通过将Rh3GT与其他功能基因共表达，实现目标花青苷的积累，进而改变杜鹃花色。

为进一步验证Rh3GT的功能，本研究通过构建原核表达载体pET-28a-Rh3GT，在大肠杆菌BL21中成功表达Rh3GT重组蛋白，其大小与理论预测值一致，但几乎都以包涵体的形式存在。有研究发现，蛋白质合成速度过快会影响复杂结构蛋白质折叠而形成错误折叠的不溶性蛋白[34]。为降低蛋白合成速率获得可溶性蛋白，本研究通过降低菌液OD600的起始值、温度、IPTG浓度，并通过延长诱导时间保证重组蛋白有足够的时间进行正确折叠。优化这些诱导条件后，Rh3GT重组蛋白仍以包涵体形式存在。这可能是由于pET-28a的T7强启动子导致蛋白合成速率仍然过快，后续可以考虑换用弱启动子载体，如pGEX系列等。本研究直接使用包涵体变性纯化和稀释复性的方式制备可用于体外酶活检测的重组蛋白。

有研究表明，所有的3GT对底物均存在特异性结合，有些3GT以花青素为糖基受体，另一些则以其他类黄酮作为糖基受体[26]，例如槲皮素、山奈酚等[24]。本研究结果显示Rh3GT能以矢车菊素为受体，以UDP-葡萄糖为糖基供体催化生成矢车菊素3-O-葡萄糖苷。这与马缨杜鹃[12]、苦荞(Fagopyrum tataricum)[13]中的测定结果一致，证明Rh3GT重组蛋白具有类黄酮3-O-糖基转移酶的活性特征，能与矢车菊素特异性结合。另有研究发现，矢车菊素3-O-葡萄糖苷是红色杜鹃花的主要花青苷[35]，推测Rh3GT对比利时杜鹃花呈色起重要作用。这为进一步验证Rh3GT基因的功能和潜在的分子育种奠定了基础。

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