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基于斑马鱼模型和网络药理学的甘草酸拮抗乌头碱心脏毒性作用与机制研究

来源：花匠小妙招时间：2025-05-05 08:32

摘要：目的利用斑马鱼模型结合网络药理学，研究甘草酸拮抗乌头碱心脏毒性及作用机制，探讨附子- 甘草配伍减毒的现代科学内涵。方法选用受精后48 h （48 hpf ）的健康野生型AB 系斑马鱼，脱膜后随机移入6 孔板中，每孔30 枚。对照组加入新鲜养鱼水；模型组和各药物处理组均给予乌头碱溶液，终浓度均为10 μmol/L ；各药物组同时分别给予低、中、高浓度（10 、50 、100 μmol/L ）的甘草酸、甘草素、甘草苷和低、中、高浓度（1 、5 、10 μmol/L ）的异甘草素，各组斑马鱼处理后放入恒温光照培养箱中培养至72 hpf ，在显微镜下记录斑马鱼20s 心跳并拍照，计算心率，并利用Image-ProPlus 5.0 软件计算心包面积，筛选甘草中拮抗乌头碱心脏毒性的成分。通过心脏结构与功能分析、活性氧（ROS ）和凋亡细胞检测，进一步验证甘草酸拮抗乌头碱心脏毒性作用。基于PharmMapper 、Swiss Target Prediction 、STITCH 数据库收集乌头碱毒性作用靶点，利用CTD 、GeneCards 、DisGeNET 数据库，以“ 心脏毒性”“ 心脏损伤”“ 心衰” 为关键词检索靶点，将上述两组靶点导入Draw venn 在线绘图取交集，得到乌头碱心脏毒性作用靶点集；从PharmMapper 数据库中收集甘草酸活性靶点集；将2 个靶点集共有靶点导入String 数据库进行蛋白互作分析；使用Cytoscape 3.6.0 软件对结果进行拓扑分析，以节点度值中位数为标准筛选重要靶点；得到的靶点导入DAVID 数据库，进行GO 和KEGG 分析。结果与对照组比较，模型组幼鱼心包水肿显著（P ＜0.01 ），心率显著升高（P ＜0.01 ）；与模型组比较，甘草酸与异甘草素各浓度组、甘草苷高浓度组心包面积显著下降（P ＜0.01 ），甘草酸效果更加明显且呈浓度相关性；甘草酸低和高浓度、甘草素高浓度和异甘草素低浓度拮抗乌头碱所致心率加快效果显著（P ＜0.05 、0.01 ）。甘草酸可浓度相关性地拮抗乌头碱导致的斑马鱼心室短轴缩短率降低，且高浓度组具有显著性差异（P ＜0.01 ）；甘草酸显著抑制乌头碱诱导的斑马鱼体内活性氧生成（P ＜0.01 ）；明显减弱乌头碱导致的细胞凋亡。甘草酸拮抗乌头碱心脏毒性的作用机制可能与MAPK 、GRB2 、CDC42 、EGFR 、GSK3B 、SRC 等关键靶点，以及PI3K-Akt 、Ras 、FoxO 等信号通路相关。结论甘草酸可以显著拮抗乌头碱心脏毒性，可能通过调控PI3K-Akt 、Ras 信号通路等发挥作用。

附子与甘草是七情配伍的经典药对，“ 附子之性急得甘草而后缓，附子之性毒得甘草而后解” ，传统用药经验表明甘草可减轻附子毒性［ 1 ］。研究表明心肌细胞存活率在附子- 甘草合用时比附子单用时明显提高，琥珀酸脱氢酶、Na + -K + ATP 酶和Ca 2+ -Mg 2+ ATP 酶的活性升高，可能是甘草发挥减毒作用的机制［ 2 ］。附子的主要毒性成分和强心活性成分以双酯型生物碱为主，包括乌头碱、中乌头碱和次乌头碱等［ 3-5 ］。乌头碱心脏毒性的机制与氧化应激、能量代谢、离子通道、细胞凋亡等有关［ 6-8 ］。甘草附子合用，甘草次酸和乌头碱在体内络合，乌头碱的体内含量减少，生物利用度降低，从而实现减毒功效［ 9-11 ］。朱玲英等［ 12 ］通过体外温孵代谢实验，发现甘草可使肝药酶活性升高，加快附子毒性成分的代谢，从而减毒。甘草还可调节机体代谢环境，将附子相关的多种代谢物含量降低，减弱其毒副作用［ 13 ］。甘草中的部分成分通过与附子中的毒性成分发生络合作用，产生沉淀或复合物，在人体胃肠道中可实现不同步吸收，从而达到减毒增效结果［ 14 ］。张硕峰［ 15 ］发现甘草苷可剂量相关性减少乌头碱引起的小鼠死亡，说明甘草苷对乌头碱引发的急性毒性具有缓解作用。Gong 等［ 3 ］发现异甘草素通过诱导Nrf2 通路激活解毒系统，这可能是甘草解毒的潜在机制。另有研究表明，甘草酸、甘草苷可能通过抗炎、抗氧化、抗凋亡、抗心室重构等作用拮抗附子毒性［ 16-18 ］。甘草酸、甘草素、甘草苷和异甘草素等甘草解毒成分拮抗乌头碱心脏毒性的差异尚未见报道，且其毒性作用机制有待进一步阐明。

斑马鱼与人类基因组同源性高，具有体外受精、生长周期短、早期胚胎透明、实验周期短、所需化合物量少、符合“3R” （替代、减少、优化）原则等优势［ 5 ］。斑马鱼心脏结构和功能与哺乳动物高度相似，拥有与人类hERG 通道相类似的zERG 通道，使得斑马鱼成为心血管活性与安全性评价中的重要模式生物之一。网络药理学已成为中药药效与作用机制研究的一种有效技术手段。本研究利用斑马鱼模型，评价甘草酸、甘草素、甘草苷、异甘草素对乌头碱心脏毒性的拮抗作用，并利用网络药理学预测甘草酸的减毒作用机制，为阐释附子- 甘草配伍减毒的现代科学内涵提供参考。

1材料

1.1实验动物

本实验所用野生型AB 斑马鱼和转基因斑马鱼Tg （cmlc2 ：EGFP ）均由山东省科学院生物研究所斑马鱼药物筛选平台提供。斑马鱼成鱼在（28 ±0.5 ）℃ 下饲养，明暗周期为14 h/10 h ，每日喂食2 次。于前一天晚间选择健康的成年斑马鱼以雌雄比例2∶2 放入排卵盒，次日亮灯时抽板，2h 内收集鱼卵，鱼卵在28 ℃ 恒温光照培养箱中培养至受精后48 h （48 hpf ）。

1.2药物与主要试剂

1.3主要仪器

斑马鱼养殖系统（北京爱生科技有限公司）；HPG280BX 光照培养箱（哈尔滨市东联电子技术开发有限公司）；Zeiss AXIO zoom V16 体视荧光显微镜（德国卡尔蔡司）；OLYMPUS 倒置荧光显微镜（奥林巴斯（中国）有限公司）。

2方法

2.1甘草中的4种化合物拮抗乌头碱心脏毒性比较

前期预试验结果表明，10 μmol/L 乌头碱可导致斑马鱼心包增大、心动过速、静脉窦- 动脉球（SV-BA ）距离增加、射血分数降低，引起明显的心脏毒性。本实验选用48 hpf 健康野生型AB 系斑马鱼，脱膜后随机移入6 孔板中，每孔30 枚。对照组加入新鲜养鱼水；模型组和各药物处理组均给予乌头碱溶液，终浓度均为10 μmol/L ；各药物组同时分别给予低、中、高浓度（10 、50 、100 μmol/L ）的甘草酸、甘草素、甘草苷，和低、中、高浓度（1 、5 、10 μmol/L ）的异甘草素。各组斑马鱼处理后放入恒温光照培养箱中培养至72 hpf ，在显微镜下记录斑马鱼20s 心跳并拍照，计算心率，并利用Image-ProPlus 5.0 软件计算心包面积。

2.2甘草酸拮抗乌头碱心脏毒性作用评价

选用48 hpf 心肌细胞荧光标记的转基因斑马鱼Tg （cmlc2 ：EGFP ），按照“2.1” 中给药方法，给药组仅给予低、中、高浓度（10 、50 、100 μmol/L ）甘草酸，给药24 h 后，在倒置荧光显微镜下记录斑马鱼俯卧位心跳视频，利用cellSensStandard 软件提取心室舒张末期和收缩末期图片。利用Image-Pro Plus 5.0 软件测量心室舒张末期静脉窦- 动脉球（SV-BA ）距离；测量心室舒张末期和收缩末期短轴、长轴长度，计算短轴缩短率、射血分数、每搏输出量、心搏量，计算与对照组相对值。

2.3活性氧（ROS）含量测定

按照“2.2” 项中给药方法处理斑马鱼，给药24h 后，DCFH-DA 荧光探针28 °C 避光孵育30 min ，麻醉后在荧光显微镜下从侧面拍照。使用Image-Pro Plus5.0 软件统计斑马鱼心脏区域ROS 含量，计算与对照组相对值。

2.4吖啶橙（AO）染色

按照“2.2” 项中给药方法处理斑马鱼，给药24h 后，AO 染色液28 °C 避光孵育20 min ，麻醉后在荧光显微镜下从侧面拍照，观察心肌细胞凋亡水平。

2.5甘草酸拮抗乌头碱心脏毒性网络药理学研究

2.5.1甘草酸活性靶点与乌头碱心脏毒性靶点的收集从PharmMapper 、Swiss Target Prediction 、STITCH 数据库中收集乌头碱毒性作用靶点，利用CTD 、GeneCards 、DisGeNET 数据库，以“ 心脏毒性”“ 心脏损伤”“ 心衰” 为关键词，检索靶点。将上述两组靶点导入Draw venn 在线绘图取交集，得到乌头碱心脏毒性作用靶点集。从PharmMapper 数据库中收集甘草酸活性靶点集。

2.5.2蛋白质相互网络构建与分析使用Draw venn 对“2.5.1” 项中获得的2 个靶点集取交集，将交集导入String 数据库，选择人源，得到蛋白- 蛋白网络互作（PPI ）结果，使用Cytoscape 3.6.0 软件对结果进行拓扑分析，以节点度值中位数为标准筛选重要靶点。

2.5.3生物学过程及通路富集分析将“2.5.2” 项中得到的靶点导入DAVID 数据库，进行GO 和KEGG 分析，使用条形图对GO 分析结果进行可视化处理，并用Omicshare3.0 数据库对关键通路进行可视化处理。

2.5.4成分- 靶点- 通路网络构建使用Cytoscape 3.6.0 软件，构建甘草酸成分- 靶点- 通路网络，成分、靶点和通路以节表示，它们之间的联系以边表示。

2.6数据统计

所有数据均以±s 表示，使用GraphPadPrism 6 进行数据统计，并进行单因素方差（one-way ANOVA ）分析。

3结果

3.1甘草中4种化合物拮抗乌头碱心脏毒性比较

如图1 所示，与对照组比较，模型组幼鱼心包水肿明显，乌头碱可致斑马鱼心包面积由4 000 μm 2 增大至10 000 μm 2 ，差异显著（P ＜0.01 ）；与模型组比较，甘草酸与异甘草素各浓度组均可明显减轻乌头碱所致心包水肿，心包面积显著下降（P ＜0.01 ），但甘草酸组效果更加明显且呈浓度相关性；甘草苷高浓度组也可拮抗乌头碱所致心包水肿，心包面积显著下降（P ＜0.01 ）；甘草素各处理组均无显著性差异。与对照组比较，模型组心率显著升高（P ＜0.01 ）；与模型组比较，甘草酸低、高浓度，甘草素高浓度，和异甘草素低浓度拮抗乌头碱所致心率加快效果显著（P ＜0.05 、0.01 ）。结果提示，甘草酸拮抗乌头碱所致心脏毒性效果最明显。

3.2甘草酸拮抗乌头碱心脏毒性作用评价结果

如图2 所示，与对照组比较，模型组SV-BA 距离显著增加（P ＜0.01 ），射血分数、短轴缩短率、每搏输出量、心搏量均显著降低（P ＜0.01 ）；甘草酸对乌头碱导致的斑马鱼SV-BA 距离增加和射血分数降低无明显的恢复作用。甘草酸可浓度相关性地拮抗乌头碱导致的斑马鱼心室短轴缩短率降低，且高浓度组具有显著性差异（P ＜0.01 ）。甘草酸可一定程度上恢复乌头碱导致的斑马鱼每搏输出量、心搏量降低，差异无统计学意义。

3.3ROS含量检测

如图3 所示，与对照组比较，模型组心脏部位（红色虚线范围内）荧光强度明显增加，差异显著（P ＜0.01 ）；与模型组比较，甘草酸各浓度组心脏部位荧光强度均明显降低，差异显著（P ＜0.01 ）。结果表明，甘草酸可抑制乌头碱诱导的斑马鱼体内ROS 生成。

3.4吖啶橙染色结果

如图4 所示，与对照比较，模型组斑马鱼心脏部位出现大量致密荧光点（白色箭头指示），说明乌头碱可使斑马鱼心脏区域发生细胞凋亡；与模型组比较，甘草酸组心脏区域荧光点明显减少，说明甘草酸可以减弱乌头碱导致的细胞凋亡。

3.5网络药理学结果

3.5.1甘草酸活性靶点与乌头碱毒性靶点PPI 结果共得到甘草酸活性靶点293 个，乌头碱潜在毒性作用靶点306 个，PPI 结果见图5 ，拓扑分析结果以度值中位数筛选得到64 个重要靶点，主要为ALB 、EGFR 、MAPK1 、IGF1 、SRC 、CASP3 、HSP90AA1 、ESR1 、MAPK8 、MMP2 等。

3.5.2生物过程和通路富集分析结果如图6 所示，甘草酸拮抗乌头碱心脏毒性GO- 生物过程（BP ）分析获得52 个生物过程分析，其中29 条具有显著性差异；GO- 细胞组分（CC ）分析获得7 个细胞过程分析，其中2 条具有显著性差异；GO- 分子功能（MF ）分析获得29 个分子过程分析，其中19 条具有显著性差异。KEGG Pathway 分析设定P ＜0.01 ，按照P 值从小到大排列选取相关通路前20 条，可视化处理结果如图7 所示，甘草酸可能主要通过调控PI3K-Akt 、Ras 、FoxO 等信号通路拮抗乌头碱心脏毒性。

3.5.3成分- 靶点- 通路网络的构建与分析结果如图8 所示，该网络包含56 个节点和229 条边，其中MAPK 、GRB2 、CDC42 、EGFR 、GSK3B 、SRC 等度值较高，可能为甘草酸拮抗乌头碱心脏毒性的关键靶点。

4讨论

配伍减毒增效（存效）是历代医家实践与智慧的结晶，但是，配伍减毒多沿用历史经验，缺乏现代药理学实验数据支撑。附子- 甘草药对堪称七情配伍的典范。现代研究表明甘草拮抗附子毒性的主要机制包括共煎降低乌头碱等毒性成分溶出，通过络合作用降低体内毒性生物碱含量，并加快其体内代谢，通过抗氧化、抗凋亡等拮抗乌头碱心肌细胞毒性等［ 16 ，19-20 ］。本研究首次利用野生型AB 系斑马鱼比较了甘草酸、甘草素、甘草苷、异甘草素等4 种化合物对乌头碱所致斑马鱼心动过速及心包水肿的拮抗作用，发现4 种化合物均具有一定的拮抗作用，其中甘草酸效果最好。采用心肌细胞荧光标记的转基因斑马鱼验证其拮抗作用，发现甘草酸可拮抗乌头碱导致的斑马鱼心室短轴缩短率降低，并对每搏输出量、心搏量降低具有一定的恢复趋势。该结果与李文等［ 21 ］观察到的结果相符。ROS 积累引起的氧化应激和细胞凋亡是药物毒副作用的机制之一［ 22-23 ］。本研究进一步利用活体染色的方法，发现甘草酸可显著逆转乌头碱导致的心脏区域活性氧含量和凋亡细胞数量增加，该结果表明甘草酸通过抑制体内氧化应激和心肌细胞凋亡拮抗乌头碱心脏毒性。

网络药理学预测结果表明，MAPK1 、GRB2 、CDC42 、EGFR 、GSK3B 、SRC 等可能是甘草酸拮抗乌头碱心脏毒性的关键靶点。MAPK1 是与增殖、分化、转录调控和发育等有关的MAP 激酶。GRB2 是miR-378 调控心肌细胞大小和心肌肥厚的直接靶点，在心脏成纤维细胞中，Ang II 通过GRB2 激活MAPK ，研究表明GRB2 与心脏纤维化之间存在联系［ 24 ］。CDC42 是小鼠抗心肌肥厚的分子开关，在压力负荷的心脏和心肌细胞中均可被多种激动剂特异性激活［ 25 ］。EGFR 已被证实与心肌缺血、心衰等多种心脏疾病密切相关［ 26 ］。GSK3B 编码的蛋白参与能量代谢、炎症、线粒体功能障碍和凋亡途径［ 27 ］。SRC 可激活MAPK 、PI3K/Akt 信号通路，参与细胞增殖、凋亡抑制［ 28 ］。这些关键靶点均与心肌保护和心肌毒性密切相关，其在甘草酸拮抗乌头碱的心脏毒性中的作用有待进一步实验验证。GO-BP 分析结果表明蛋白质自身磷酸化、蛋白分解、基因调控、RNA 聚合酶调控等生物途径在甘草酸拮抗乌头碱心脏毒性中起重要作用。KEGG 富集分析结果显示甘草酸主要通过调控雌激素、FoxO 、PI3K-Akt 、促性腺激素释放、T 细胞受体、Ras 、肿瘤坏死因子、ErbB 、VEGF 、Rap1 等信号通路拮抗乌头碱心脏毒性。Ras 相关蛋白能与雌激素结合，雌激素能激活P13K 信号通路，FoxO3a 作为PI3K/Akt 信号通路靶蛋白，能抗增殖和促进凋亡，T 细胞受体信号通路可以介导细胞凋亡和自噬。FoxO 信号通路与PI3K/Akt 、MAPK 等信号通路密切相关，ROS 可激活FoxO1 转录，进而调节氧化氢分解酶（Gatalase ）和锰超氧化物歧化酶（MnSOD ）活性，从而减少体内ROS 含量，缓解氧化应激反应。炎症反应、氧化应激等均可激活PI3K/Akt 信号通路，该通路可抑制Bax 等促凋亡蛋白表达，促进XIAP 等抗凋亡蛋白表达，从而抑制细胞凋亡。Liu 等［ 29 ］发现甘草酸通过调控PI3K/Akt/mTOR 信号通路调节自噬，从而减轻内毒素诱导的肺损伤。Kao 等［ 30 ］发现甘草酸可以激活PI3K/Akt 通路，降低体内活性氧含量，通过降低线粒体Bax/Bcl-2 比例缓解凋亡，保护PC12 细胞免受缺血性损伤。以上结果表明，细胞凋亡、细胞自噬、能量代谢可能是甘草酸减轻乌头碱所致心脏毒性的机制，PI3K-Akt 信号通路可能在甘草酸拮抗乌头碱心脏毒性中起主要作用。

本研究首次利用斑马鱼模型比较了甘草酸、甘草素、甘草苷、异甘草素等4 种化合物对乌头碱所致斑马鱼心动过速及心包水肿的拮抗作用，其中甘草酸通过逆转体内ROS 积累和心肌细胞凋亡，缓解乌头碱导致的斑马鱼心脏毒性。斑马鱼胚胎透明，心脏结构和功能与哺乳动物高度相似，在中药心脏毒性/ 活性评价中展现出独特的优势。本研究首次利用网络药理学方法预测了甘草酸拮抗乌头碱心脏毒性的潜在作用机制，但仍需更深入的分析和实验验证。本研究为阐明附子- 甘草配伍减毒的现代科学内涵提供了新依据。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突

参考文献（略）

来源：庄开颜，高硕，柳晴，陈锡强，刘可春，张云，夏青．基于斑马鱼模型和网络药理学的甘草酸拮抗乌头碱心脏毒性作用与机制研究 [J]. 药物评价研究, 2021, 44(7): 1368- 1376.