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花生二倍体野生种Arachis duranensis和A. ipaensis新种间杂种的创制及鉴定

来源：花匠小妙招时间：2025-05-02 12:05

花生是重要的油料作物和经济作物，我国是世界上最大的花生生产国。花生栽培种是异源四倍体（2n=4x=40），拥有A和B两个亚基因组[1, 2]，包括两个亚种（交替开花亚种和连续开花亚种）和6个植物学变种（茸毛变种、密枝变种、梳枝变种、珠豆变种、秘鲁变种和赤道变种）[3]。

目前多数研究认为花生栽培种起源于南美洲亚热带地区，它是由两个分属于A、B基因组的二倍体花生野生种杂交和自然加倍演化而来，其最可能二倍体祖先种是Arachis duranensis和A. ipaensis [4~7]。尽管如此，一些研究发现花生栽培种A亚基因组染色体与A. duranensis基因组在染色体核型和基因组序列上存在一些显著差异。事实上，目前定名的A基因组野生种有14个[8]，每个包含许多不同的系，例如：美国农业部种质资源库（https://npgsweb.ars-grin.gov/gringlobal）保存的A. duranensis就多达47个系，并且多数系在分子和细胞学上存在显著差异[9, 10]。因此在A. duranensis是A亚基因组供体及起源方式上还存在争议。例如：依据基因组序列与栽培种A亚基因组的相似性，Bertioli等[11]认为来自阿根廷Rio Seco地区的A. duranensis系是A亚基因组祖先最接近的系，花生栽培种可能起源于这些中的某个系与A. ipaensis的一次多倍体事件；Zhang等认为花生栽培种可能起源于A. duranensis与A. ipaensis的多重杂交事件等[9]；而Zhuang等认为花生栽培种可能起源于A. duranensis以外的A基因组物种与A. ipaensis的一次多倍体事件[12]。

利用人工合成多倍体解析其遗传变化过程是研究物种起源与进化的重要方式。异源多倍化引发物种基因组和表观遗传快速改变，导致物种快速二倍体化，从而促进了新的异源多倍体的建立[13]。利用二倍体祖先种合成可育的、遗传稳定的异源四倍体花生，且该四倍体能与栽培种杂交获得后代是证实花生起源的重要证据[14]。先前通过不同的A. duranensis系和A. ipaensis杂交，已合成了多个四倍体花生，这些四倍体基本上均能产生后代，但遗传稳定性上存在差异[11，15，16]。因此，有必要利用不同的A. duranensis系和A. ipaensis杂交，合成更多的四倍体花生，来研究花生的起源与进化。

本研究利用A. duranensis系和A. ipaensis杂交，通过组织培养和染色体荧光原位杂交等技术创制和鉴定新的种间杂种F1，并通过花粉育性、减数分裂行为和表型性状解析F1的生殖特性和表型遗传变化，为揭示花生栽培种的起源提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

二倍体花生野生种A. duranensis（PI 497262）和A. ipaensis（PI 468322）由河南省作物分子育种研究院保存。

1.2 方法

1.2.1 A. duranensis和A. ipaensis种间杂种F1创制及表型鉴定

首先对二倍体花生野生种A. duranensis和A. ipaensis进行人工杂交，成熟后收获荚果。用0.1%的氯化汞对荚果表面进行消毒，将种仁接种到由1/2MS和3%蔗糖组成固体培养基中，25℃（18h/6h光暗交替）培养。成苗后利用1/2MS+0.8 mg/L NAA+3%蔗糖和MS+0.1 mg/L NAA+0.4 mg/L 6-BA+3%蔗糖固体培养基对种间杂种F1植株进行组织培养。次年移栽于河南省农业科学院现代农业研究开发基地（河南原阳），并同时种植A. duranensis和A. ipaensis。生育期内对A. duranensis、A. ipaensis和种间杂种F1各4株进行表型性状调查，盛花期调查花色，成熟期调查株型、主茎高、侧枝长和叶面积。

1.2.2 种间杂种F1染色体制片

根尖细胞中期及花粉母细胞减数分裂染色体制片分别参照杜培等[17]和付留洋等[18]的方法。剪取组培苗1~1.5 cm长的根尖，用8-羟基喹啉处理3 h，然后乙醇-冰醋酸（3:1）固定6h以上，采用压片法获得中期染色体制片。种间杂种F1始花期取发育适期的花蕾，在载玻片上解剖出花药，采用常规压片法获得减数分裂制片。

1.2.3 OS FISH和GISH

为了鉴定A. duranensis、A. ipaensis及杂种F1的染色体组成，本研究使用寡核苷酸探针染色荧光原位杂交（OS FISH）和基因组荧光原位杂交（GISH），方法参照Du等[10]和杜培等[19]。利用寡核苷酸探针TAMRA-DP-1、TAMRA-DP-8、FAM-DP-5和FAM-DP-7对亲本及杂种后代中期染色体制片进行探针染色，然后再利用Biotin-16-dUTP和Digoxingenin-11-dUTP标记的A. duranensis与A. ipaensis的基因组DNA探针对杂种F1染色体进行GISH分析，然后使用4′, 6-diamidino-2-phenylindole（DAPI）染色4 min，洗去染料，盖上盖玻片，用荧光显微镜摄取图像，构建染色体核型。

为了分析A. duranensis与A. ipaensis杂种F1的花粉母细胞减数分裂行为，研究将减数分裂制片经95%酒精脱水后用A. duranensis和A. ipaensis基因组DNA为探针进行荧光原位杂交，摄取图像，分别统计10个细胞的单价体、二价体和多价体，计算染色体平均构型。

1.2.4 花粉育性分析

选取健康的花，当日将花粉置于载玻片上，加1滴1%的醋酸洋红染色，然后盖上盖玻片，并置于显微镜下观察。统计5个视野区域，染色深、形状规则的花粉粒计作可育花粉，染色浅、体积小、形状不规则的花粉粒计作不育花粉。每个材料统计两朵花，计算花粉活力，花粉活力=可育花粉数／（可育花粉数+不育花粉数）×100%。

2 结果与分析

2.1 种间杂种F1的创制和鉴定

以A. duranensis为母本和A. ipaensis为父本杂交，成熟期获得了4个杂交荚果，荚果和种子大小分别为11±0.08 mm和9.1±0.06 mm。种子经过组织培养正常发育成F1幼苗，被命名为W1824。取幼苗根尖，通过对A. duranensis（PI 497262）、A. ipaensis（PI 468322）和W1824进行探针染色，并进一步对同一张W1824染色体制片进行了GISH分析，建立其中期染色体核型（图1）。基于OS FISH核型，我们发现PI 497262、PI 468322和W1824的染色体条数均为20。PI 497262和PI 468322均包含10对同源染色体，其中PI 497262染色带型以红色信号为主（图1A），PI 468322染色带型以绿色信号为主（图1B）。W1824的GISH分析显示10条染色体信号为绿色，10条染色体信号为红色，其中绿色信号染色体的寡核苷酸染色带型与A. duranensis的带型一致，红色信号染色体带型与A. ipaensis的带型一致（图1A和1D），表明W1824是A. duranensis和A. ipaensis的真种间杂种F1。

图1 Arachis duranensis（PI 497262）和A. ipaensis（PI 468322）及其杂种W1824的OS FISH和GISH注：A~C：以TAMRA-DP-1（红色）、TAMRA-DP-8（红色）、FAM-DP-5（绿色）和FAM-DP-7（绿色）为探针的PI 497262（A）、PI 468322（B）和W1824（C）染色；D：A. duranensis（绿色）和A.ipaensis（红色）为探针的W1824基因组原位杂交；E：PI 497262、PI 468322和W1824染色体核型，OS表示寡核苷酸探针染色，GISH表示基因组原位杂交

Fig. 1 OS FISH and GISH of Arachis duranensis（PI 497262）and A. ipaensis（PI 468322）

Note: A-C: Probe staining of PI 497262 (A), PI 468322 (B) and W1824(C) with TAMRA- DP-1 (red), TAMRA- DP-8 (red), FAM-DP-5 (green) and FAM-DP-7 (green); D: GISH of W1824 with total genomic DNA of A. duranensis (green) and A. ipaensis (red); E: Karyotype of PI 497262, PI 468322 and W1824, OS shows oligonucleotide probe staining FISH, GISH shows genomic in situ hybridization

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2.2 种间杂种F1花粉育性和减数分裂行为分析

用A. duranensis和A. ipaensis基因组DNA为探针对种间杂种W1824的减数分裂制片进行DAPI染色（图2A和2C）和GISH分析（图2B和2D），可以明显地看出花粉母细胞中存在染色体联会（图2B和2D），统计结果得出W1824染色体平均构型为0.5 III+3.5 II+11.5 I。基于GISH结果，发现主要存在3种二价体形式，即A和B基因组染色体形成的二价体（A/B二价体）、A和A基因组染色体形成的二价体（A/A二价体）、B和B基因组染色体形成的二价体（B/B二价体）；而三价体形式只有一种即A/B/B三价体（表1）。进一步利用醋酸洋红进行花粉粒染色，发现F1花粉活力在1.74%~3.68%之间（图3A，表2），表明种间杂种W1824高度不育。

图2 W1824花粉母细胞减数分裂终变期染色体DAPI染色和GISH注：A和C：DAPI染色；B和D：A. duranensi（绿色）和A.ipaensis（红色）为探针的W1824减数分裂染色体基因组原位杂交，黄色箭头表示A和B基因组染色体间的二价体，红色箭头表示B基因组非同源染色体间的二价体

Fig. 2 DAPI staining and GISH of W1824 at diakinesis during meiosis

Note: A and C: DAPI staining; B and D: GISH of W1824 with total genomic DNA of A. duranensis (green) and A. ipaensis (red) at diakinesis, yellow arrows show oligonucleotides probe staining, GISH shows genomic in situ hybridization

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表1 W1824减数分裂染色体联会情况

Table 1 Chromosomal associations in W1824 during meiosis

单价体

Monovalent

二价体

Bivalent

三价体

Trivalent

A/B二价体

Bivalent of A/B

A/A二价体

Bivalent of A/A

B/B二价体

Bivalent of B/B

A/B/B三价体

Trivalent of A/B/B

W1824-1 13 2 1 2 0 0 1 W1824-1 14 3 0 2 0 1 0 W1824-2 14 3 0 2 0 1 0 W1824-2 9 4 1 2 1 1 1 W1824-3 11 3 1 3 0 0 1 W1824-3 7 5 1 3 1 1 1 W1824-4 8 6 0 4 1 1 0 W1824-4 16 2 0 2 0 0 0 平均 Average 11.5 3.5 0.5 2.5 0.375 0.625 0.5

图3 W1824的花粉染色（A）及W1824、PI 497262和PI 468322的叶部形态(B)、花色（C）和株型(D)，红色箭头所示为可育花粉粒

Fig. 3 Pollen staining of W1824 (A), and Morphologies of leaves (B), flower color (C) and plant (D) of W1824, PI 497262 and PI 468322, red arrows show fertile pollens

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表2 A. duranensis和A. ipaensis杂种F1花粉活力情况

Table 2 Pollen activity of the interspecific hybrid between A. duranensis and A. ipaensis

不育花粉

Sterile pollen

可育花粉

Fertile pollen

花粉活力

Pollen viability/%

W1824-1 531 14 2.57 W1824-2 453 8 1.74 W1824-3 261 9 3.33 W1824-4 366 14 3.68

2.3 表型鉴定

为了进一步了解A. duranensis和A. ipaensis种间杂种F1的遗传特性，对W1824及其亲本的主茎高、侧枝长、叶面积、花瓣颜色和株型等植物学性状进行了调查，每个材料各调查5株。结果表明，W1824的主茎高、侧枝长、叶面积与两个亲本相比均差异极显著，且均明显增加，表现出超亲优势（图3B、3D和表3）。W1824的株型与两亲本一样表现为蔓生，但花瓣颜色与二倍体母本PI 497262一致，表现为黄色，不同于父本PI 468322的橙黄色花瓣（图3C和表3）。此外，自然条件下对5株种间杂种W1824的结实情况和花粉育性调查，未发现染色体加倍单株，仅发现一株生长了一个果针，成熟期荚果膨大，但胚发育不成熟，最终未能获得植株。

表3 杂种W1824与亲本表型性状比较

Table 3 Comparison of interspecific hybrid W1824 with its parents in phenotypic traits

性状 Trait PI 497262（♀） PI 468322（♂） W1824（F1） t-test （F1/♀） t-test （F1/♂）主茎高 Height of main stem/cm 33.33±5.51 27.83±4.80 160.00±23.30 9.31** 9.62** 侧枝长Length of first primary branch/cm 86.00±5.57 65.33±6.66 160.67±14.29 8.43** 10.47** 叶面积Leaf area/mm2 206.52±28.89 481.25±43.42 699.57±72.14 14.19** 5.80** 花瓣颜色 Petal color 黄Yellow 橙黄Orange 黄Yellow / / 株型 Plant type 蔓生Procumbe 蔓生Procumbe 蔓生Procumbe / /

3 讨论与结论

两个二倍体野生祖先种能够顺利杂交、自然加倍和正常结实的属性对异源四倍体花生的形成至关重要[14]。利用A基因组与B基因组野生种杂交和秋水仙素染色体加倍，先前已经合成了多个四倍体花生，依据杂交亲和性和分子细胞学等结果，认为A. duranensis与A. ipaensis是花生栽培种最可能的二倍体祖先种[11, 14, 16]。尽管如此，目前尚未有杂种一代自然加倍获得四倍体花生的报道。本研究发现利用不同于先前的A. duranensis系和A. ipaensis杂交，获得了成熟的种仁，且它们能够正常萌发生长成F1植株，进一步证实两者存在较高的杂交亲和性。但种间杂种W1824花粉育性很低，不能正常结实，且未观测到自然加倍植株。当然这可能与目前观测F1的植株数量和环境条件有关，因此未来还需要在不同环境观测更多F1植株，并且未来利用更多A基因组物种或系与A.ipaensis进行正反交试验观测其育性、自然加倍和结实情况。

多倍体在形成初期由于剧烈的基因组冲击会衍生出一系列变化，如：染色体稳定性、基因表达、表型等变化[20]。可育配子的产生和保持是多倍体适应性的关键，因此减数分裂过程中的染色体正确分离显得尤为重要，但许多新形成的多倍体表现出减数分裂的异常现象[21, 22]。为了使不同基因组在相同的细胞核环境中和谐相处，新生异源多倍体会诱发遗传学和基因表达的变化来应对基因组间的不兼容性[23，24]。利用V14167（A. duranensis）与K30076（A. ipaensis）杂交和ICG 8123（A. duranensis）与ICG 8206（A. ipaensis）杂交合成了四倍体花生，其花瓣颜色均为黄色，与A基因组物种A. duranensis的花色一致[11，14]。而几乎所有花生栽培种与B基因组A. ipaensis花色一致，都是橙色花，因此认为橙色花是四倍体花生演化初期A和B基因组染色体交换产生的[11]。本研究利用不同于上述的A. duranensis系与A. ipaensis杂交，获得了杂种F1，并利用OS FISH和GISH证明其为真杂种，杂种F1花色也显示为黄色，与前人结果一致。此外，本研究还发现种间杂种F1减数分裂过程中染色体联会形成了二价和三价体，因此，由其衍生的四倍体花生可能会发生部分同源染色体或非同源染色体间的交换，导致染色体很难稳定遗传。Ph1基因在小麦异源六倍体形成初期快速发挥功能，有效抑制了部分同源染色体间重组和交叉，保证了六倍体小麦在减数分裂过程中正常的二倍化染色体行为[25]。花生形成过程中是否存在类似的基因或者是其它方式抑制部分同源染色体配对尚需进一步研究。

花生二倍体野生种包含了许多栽培种不具备的优异基因，人工合成四倍体花生继承了野生种的特性且更容易与花生栽培种杂交获得可育后代，是花生改良的重要资源。本研究发现W1824的主茎高、侧枝长和叶面积均明显增加，表现出超亲优势，暗示了人工合成四倍体花生相对于亲本具有更高的生物产量。对A. duranensis与A. ipaensis的人工合成四倍体花生的抗性鉴定表明其高抗晚斑病等[15]。尽管如此，目前人工合成四倍体数量较少，优异基因挖掘不足，未来还需深入研究。

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