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（园林植物与观赏园艺专业论文）蜡梅花β葡萄糖苷酶的活性分析、分离纯化与性质的初步研究.pdf

来源：花匠小妙招时间：2025-02-20 12:33

文档简介

蜡梅花1 3 一葡萄糖苷酶的活性分析、分离纯化与性质的初步研究摘要 0 葡萄糖苷酶是香花中醇系香气形成的关键酶类。本文在优化b 一葡萄糖苷酶提取以及活性分析条件的基础上，比较蜡梅不同品种和鲜花开放不同时期0 葡萄糖苷酶活性的变化，并首次对蜡梅花1 3 葡萄糖苷酶进行分离纯化和有关酶学性质的研究，为今后深入研究蜡梅花香形成机理提供理论依据。本项研究主要研究结果如下： 1 蜡梅花1 3 葡萄糖苷酶提取和活性分析条件的优化。以p n p g 为底物，对蜡梅花中b 葡萄糖苷酶提取和活性分析条件进行了研究。结果表明，p v p 加入量对酶活性影响较大。随着p v p 加入量的增大，酶活性呈现上升的趋势当p v p 加入量与花等量时，酶活性达到最大值。缓冲液类型和p h 值对酶活性也有较大影响。随着p h 值的增大，酶活性均呈现先增后减的趋势，当p h 为 5 0 时酶活性达到最大值。在相同p h 条件下，柠檬酸柠檬酸三钠提取的酶活性最大。酶的吸收波长分析结果表明，在波长为4 1 0 n m 下测定b 葡萄糖苷酶，能获得最大的光吸收值。酶促反应以3 7 c 为宜，在此条件下反应1 2 0 分钟内酶活性分析结果具有稳定性。据此，t 3 葡萄糖苷酶提取条件为：加入与花等量的p v p ，以p h 为5 0 的柠檬酸柠檬酸三钠作为提取缓冲液：而1 3 葡萄糖苷酶活性分析的条件为：酶促反应温度为3 7 ，反应时间为1 2 0 分钟内，测定波长为4 1 0 h m 。 2 蜡梅不同品种和鲜花开放不同时期b 葡萄糖苷酶活性变化素心蜡梅i 、素心蜡梅i i 、罄口蜡梅和狗蝇蜡梅花中1 3 葡萄糖苷酶活性变化的研究表明，从黄蕾到全开过程，素心蜡梅i i 花中b 葡萄糖苷酶活性均高于其它蜡梅品种，素心蜡梅i 和罄口蜡梅居中，而狗蝇蜡梅最低。在鲜花开放的不同时期，不同蜡梅品种鲜花b 葡萄糖苷酶活性的变化趋势大体上一致，均表现为黄蕾初开全开青蕾萎蔫，从黄蕾到全开过程b 葡萄糖苷酶活性略有下降，但保持在较高水平，而从全开到萎蔫的过程酶活性下降迅速。提示蜡梅花香气的变化与内源b 葡萄糖苷酶的活性有关。 3 b 葡萄糖苷酶的分离纯化采用硫酸铵分级沉淀法和c m 5 2c e l l u l o s e 离子交换层柝法对素心蜡梅l i 花中1 3 葡萄糖苷酶进行分离纯化，得到g l u c o s i d a s e i 、g l u c o s i d a s e i i 和g l u c o s i d a s e i i b 个酶级分。利用s e p h a d e xg 一1 0 0 葡聚糖凝胶柱层析对主要级分g l u c o s i d a s e i i i 进一步纯化，能得到纯度较高的0 葡萄糖苷酶主要级分g l u c o s i d a s e i i i ，该酶的纯化倍数提高了1 2 6 倍，得率为2 4 ，比酶活为0 2 4 4 u m g 。 4 b - 葡萄糖苷酶的酶学性质研究 g l u c o s i d a s e i i i 酶学性质研究表明，该酶最适p h 为4 0 ，在p h 4 o 一6 0 之间比较稳定，最适温度为5 0 ，热稳定范围在3 0 一4 0 之间：g l u c o s i d a s e i i i 酶可能由分子量为6 4 5 k d 和4 2 0 k d 的两种亚基组成；对底物p n p g 的米氏常数k 。为 o 2 3 m m o i l ，最大反应速度v 二。为1 2 2 4 u l ；h 矿+ 、a g + 、s d s 对g l u c o s i d a s e i l l 有强的抑制作用，c u ”、f e ”对酶有一定的抑制作用；在4 c 下保存一个月，酶活性仍在8 0 以上。由此说明蜡梅花的g l u c o s i d a s e i i i 对底物有着很强的亲和力，其热稳定性不高，活性明显受某些金属离子和抑制剂的影响。关键词：蜡梅b 葡萄糖苷酶提取活性分离纯化酶学性质 2 p r e l i m i n a r ys t u d i e so na c t i v i t y , p u r i f i c a t i o na n d c h a r a c t e r i z a t i o no fb - g l u c o s i d a s ei nc h i m o n a n t h u s p r a e c o xl a b s t r a c t b - g l u c o s i d a s ei s o n eo ft h ek e ye n z y m e s ，w h i c hp l a y sa n i m p o r t a n tr o l ei n a l c o h o l i ca r o m af o r m a t i o no ff r a g r a n tf l o w e r s u n d e rt h eo p t i m i z e dc o n d i t i o n sf o rt h e e n z y m ee x t r a c t i n ga n da c t i v i t ya n a l y s i s ，w ec o m p a r e dt h ec h a n g e so fb g l u c o s i d a s e a c t i v i t yd u r i n gd i f f e r e n ts t a g e so ff l o r e s c e n c ea m o n gd i f f e r e n tc u l t i v a r so fc h i m o n a n t h u s p r a e c o x 以) f u r t h e r m o r e , b g l u c o s i d a s ew a sp u r i f i e da n di t sc h a r a c t e r i z a t i o nw a s s t u d i e df o rt h ef i r s tt i m e t h i sw i l le s t a b l i s ht h e o r e t i c a lf o u n d a t i o nf o rf u r t h e rr e s e a r c ho n t h em e c h a n i s mo fa r o m af o r m a t i o ni nt h ef l o w e r so fc h i m o n a n t h u sp r a e c o x ( l ) i nt h e f u t u r e t h em a i nr e s u l t sa r ea sf o l l o w s ： 1o p t i m i z a t i o no f c o n d i t i o n sf o re x t r a c t i n ga n da e t i v i t ya n a l y s i so f1 3 - g l u c o s i d a s e u s i n gp - n i t r o p h a n y lb - d g l u o p y r a n o s i d e ( p n p g ) a ss u b s t r a t e ，t h ec o n d i t i o n sf o r e x t r a c t i n ga n da c t i v i t ya n a l y s i so fb - g l u c o s i d a s ei nt h ef r e s hf l o w e r so fc h i m o n a n t h u s p r a e c a x( l ) w e r es t u d i e d t h er e s u l t si n d i c a t e dt h a tt h ea m o u n t o f p o l y v i n y p o l y p y r r o l i d o n e ( p v p ) h a dg r e a ti m p a c to n6 - g l u c o s i d a s ea c t i v i t yw h e nt h e e n z y m ew a se x t r a c t e d w i t ht h ea m o u n to fp v pi n c r e a s i n g ，t h ee n z y m ea c t i v i t yh a dt h e t r e n dt oa s c e n d i ta t t a i n e dt h ea p e xw h e nt h ea m o u n to fp v pw a se q u a lt ot h a to ff r e s h f l o w e r s t h er e s u l t sa l s os h o w e dt h a t b - g u c o s i d a s ea c t i v i t yw a se f f e c t e db yd i f f e r e n t b u f f e r sa n dp hv a l u e s a sp hv a l u er o s et o5 0 ，b - g l u c o s i d a s ea c t i v i t yi n c r e a s e dt o m a x ，a n dt h e nd e c r e a s e d a tt h es a l n ep hv a l u e ，e n z y m ea c t i v i t yw a st h eh i g h e s tw i t h c i t r i ca c i d c i t r i ca c i dn ab u f f e r e n z y m ea c t i v i t ya n a l y s i sr e v e a l e dt h a tt h eh i g h e s t a s o r b a n c ev a l u ec o u l db eo b s e r v e dw h e nt e s t i n gw a v e l e n g t hw a s4 1 0 n m i tw a sf o u n d t h a tt h ee n z y m a t i cr e a c t i o nw a ss t a b l ea t3 7 0 ci n1 2 0 m i n i nc o n c l u s i o n ，t h ee x t r a c t i n g c o n d i t i o n so fb g l u c o s i d a s ew e r et h a tt h ea m o u n to fp v ps h o u l db ee q u a lt ot h a to f f l e s hf l o w e r su s i n gc i t r i ca c i d - c i t r i ca c i dn a ( p h 5 o ) a se x t r a c t i n gb u f f e r t h ee n z y m a t i c r e a c t i o ns h o u l db ep e r f o r m e da t3 7 ci n1 2 0 r a i na n dt h et e s t i n gw a v e l e n g t ho u 曲tt ob e 4 1 0 n m ， 2 c h a n g e so f1 3 - g l u c o s i d a s ea c t i v i t yd u r i n gd i f f e r e n ts t a g e so ff l o r e s c e n c ea m o n g d i f f e r e n tc u l t i v a r s t h ec h a n g e so fb g l u c o s i d a s ea c t i v i t ya m o n gf o u rc u l t i v a r so fc h i m o n a n t h u s p r a e c o x ( l ) ，n a m e l yc h i m o n a n t h u sp r a e c o xv a r c o n c o l o ri ，c h i m o n a n t h u sp r a e c o xv a t c o n c o l o r 儿。c h i m o n a n t h u sp r a e c o xv a r i n t e r m e d i u sa n dc h i m o n a b t h u sp r a e c o xv a r g r a n d i f l o r a ，w e r ei n v e s t i g a t e di nt h i sp a p e r a sar e s u l t ，f r o my e l l o wb u dt of u l l b l o w n ， 3 t h et e n d e n c yo ft h e 一g l u c o s i d a s ea c t i v i t yw a sc h i m o n a n n u s p r a e c o xv a r c o n c o l o ri i c h i m o n a n t h u sp r a e c o xv a t g r a n d i f l o r a c h b n o n a n 蛹u sp r a e c o xv a r c o n c o l o ri c h i m o n a n t h u sp r a e c o xv a r i n t e r m e d i u s d u r i n gd i f f e r e n ts t a g e so ff l o r e s c e n c e ，t h e c h a n g e so fb g l u c o s i d a s ea c t i v i t yw e r es i m i l a ra m o n gt h ef o u rc u l t i v a r s 1 m et r e n dw a s y e l l o wb u d i n i t i a ls t a g e so ff l o r e s c e n c e f u l l - b l o w n g r e e nb u d w i t h e r i n g f r o m y e l l o wb u dt of u l l b l o w nt h ee n z y m ea c t i v i t yp r e s e r v e dr a t h e rh i g ht h o u g hi t d e c r e a s e d s l o w l y ，t h e nr a p i d l yf r o mf u l l b l o w nt ow i t h e r i n g i th i n t e dt h a tt h ec h a n g eo fa r o m ai n c h i m o n a n t h u s p r a e c o x ( k ) f l o w e r sw a s r e l a t e dt ot h ee n d o g e n o u s8 * g l u c o s i d a s ea c t i v i t y 3i s o l a t i o na n dp u r i f i c a t i o no f1 3 - g l u c o s i d a s e b yt h em e t h o d so fa m m o n i u ms u l f a t ep r e c i p e t a t i o na n dc o l u m nc h r o m a t o g r a p h yo n c m - 5 2c e l l u l o s e 。1 3 g l u c o s i d a s ei nt h ef l o w e r so fc h i m o n a n t h u s p r a e c o xv a t c o n c o l o ri t w a sp u r i f i e d 麓辩ef a c t i o n s , n a m e l yg l u c o s i d a s e 一，g l u c o s i d a s e - t ia n dg l u c o s i d a s e i i i ， w e r eo b t a i n e d t h r o t 【g l ls e p h a d e xg - 1 0 0g e lf i l t r a t i o nc h r o m a t o g r a p h y ，g l u c o s i d a s e i i i ， t h em a i nf a c t i o no f 1 3 - g l u c o s i d a s e ，w a sl u t h e rp u r i f i e d1 2 6f o l dw i t has p e c i f i ca c t i v i t yo f 0 2 4 4 u m ga n day i e l do f2 4 。 4r e s e a r c ho nc h a r a c t e r i z a t i o no f g l u c o s i d a s e r e s e a r c ho nt h ec h a r a c t e r i z a t i o no ft h ep u r i f i e dg l u c o s i d a s e 。1 1 ip r o v e dt h a tt h e e n z y m es h o w e do p t i m a la c t i v i t ya tp h 4 0a n d5 0 c i tw a ss t a b l ei nt h ep hr a n g ef r o m 4 0t o6 0a n dt e m p e r a t u r er a n g ef r o m3 0 * ( 2t o 羽。t h ee n z y m em i g h tb ec o n s i s t e do f t w om o n o m e r s ，w h i c hm o l e c u l a rw e i g h t sw e r e6 4 5a n d4 2 0k d a ，r e s p e c t i v e l y i tw a s a l s oj n d i c a t e dt h a tt h ea p p a r e n tm i e h a e l i sc o n s t a n tf o rp n p gw a s0 2 3 m m o l 几a n dv m “ w a s1 2 + 2 4 u l 。强ee n z y m ea c t i v i t yw a si n h i b i t e db yh f + ，a g + a n ds d ss t r o n g l y ，b u t s l i g h t l yb yc u 2 + a n df e 2 + 髓es u r v i v a lr a t eo fe n z y m ea c t i v i t yr e m a i n e do v e r8 0 w h e n s t o r e da t4 f o ram o n t h s oi tc o u l db ec o n c l u d e dt h a tg ! u c o s i d a s e i i ih a das t r o n g a f f i n i t yf o rp n p g ，e x h i b i t e dp o o rt h e r m o s t a b i t i t ya n dw a se v i d e n t l yi n h i b i t e db ys o m e m e t a li o n sa n di n h i b i t o r s k e yw o r d ：c h i m o n a n t h u sp r a e c o x ( l ) ；b g l u c o s i d a s e ；e x t r a c t i o n ；a c t i v i t y ； p u r i f i c a t i o n ；c h a r a c t e r i z a t i o n 4 1 关于蜡梅 1 1 形态特征第一章文献综述蜡梅 c h i m o n a n t h u sp r a e c o x ( l 川，又名蜡木、黄梅、香梅、蜡花等，属于蜡梅科蜡梅属是原产我国的一种古老的珍贵花木，在我国已有一千多年的裁培历史1 1 j 。早在宋代范成大梅谱( 1 1 8 6 ) 记载：“蜡梅本非梅类；以其与梅同时，香又相近：色，色酷似蜜脾，故名蜡梅”。蜡梅，落叶丛生灌木，在暖地也半常绿，高达3 米。小枝近方形。叶对生，半革质，椭圆状卵形至卵状披针形，长7 1 5 厘米，叶端渐尖，叶基圆形或广楔形，叶表有硬毛。叶背光滑。花单生，径约2 5 c m ；花被外轮蜡黄色；有浓香。花期1 2 3 月，远在叶前开放；果八月成熟1 2 j 。 1 2 资源分布蜡梅原产于我国中部秦岭、大巴山、武当山等山区。由于适应性强，在我国栽培普遍，北至北京，南至广东、广西，东到上海，西到成都、昆明。其中，河南省鄢陵县栽培历史最为悠久，曾是蜡梅苗木生产的中心。目前苏、浙、鄂、豫、皖、陕、川、沪等省市是我国蜡梅的主要栽培地区【3 1 。 1 3 蜡梅花香气的研究蜡梅由于生命力强，观赏性高，越来越受到国内外园林界的重视。目前国内外对蜡梅的研究主要集中在种质资源的搜集和品种分类上1 4 。】。蜡梅花开于百花凋零的冬季，花朵密布枝条，花期可长达2 3 个月，清丽淡雅，具有怡人的芳香，故蜡梅不仅是珍贵的花木，而且是重要的天然香料植物，但这些尚未引起国内学者的足够重视。目前，国外已经开始了蜡梅香精油的开发研究工作，日本等国的科学家把蜡梅香精油与玫瑰油、茉莉花精油成分进行了比较，蜡梅香精油具有1 6 1 种成分，玫瑰及茉莉花精油成分仅分别为1 3 0 种和1 0 0 种，充分显示了蜡梅香精的利用潜力1 8 j 。但迄今为止，尚未见到对其香气释放机理的报道。因此，探明香气产生的主要前体物质以及催化这些前体物释放香气的相应酶类，对于蜡梅香气研究具有重大的意义。日本学者吉村等人的研究表明，蜡梅的主要香气成分是芳樟醇，而己醇和庚醇等主要赋与它绿草香韵【9 1 。醇系香气作为植物自然香气中的一大类己成为目前香气研究中的一个热点，分离纯化植物中的香气前体物质和探明分解这些前体物质的酶，是研究醇系香气形成机理的两个基本点。目前，植物醇系香气产生的机理研究已有甚多报道，认为是以1 3 - 葡萄糖营酶( e c 3 ，2 ，1 ，2 1 ) 为主的糖苷酶，对香气前驱体进行的水解过程。芳樟醇和单萜烯等醇系香气成分以结合态糖苷前体形式存在于鲜花f 茉莉和栀子花等1 、茶叶和水果，在内源糖苷酶的水解作用下释放出来，这已得到许多资料的证实 2 0 8 2 - 9 11 。由此推断，蜡梅的醇系香气的形成可能与b 一葡萄糖苷酶有着重要的关系。 2 关于1 3 葡萄糖苷酶 1 3 - 葡萄糖苷酶( e c 3 ，2 ，1 ，2 1 ) 又称为1 3 d 葡萄糖苷水解酶，英文名是b e t a g l u c o s i d a s e ，它属于纤维素酶类，存在于自然界许多植物体、酵母、曲霉菌、木霉菌属及细菌内f “。植物不同的组织器官中均有分布，酶活性在叶、茎干、根表皮，果实、种皮中随着植物的种类而变化。在细胞水平上，1 3 葡萄糖苷酶不是分布在某个特定的细胞器，细胞质中的含量较高，但也有关于细胞壁、叶绿体、胞质丝、液泡中存在该酶的报道【7 l 】。在植物体内，且葡萄糖苷酶通过水解作用来参与和影响植物的生理生化过程，主要有：( 1 ) 激素的储存与代谢：( 2 ) 细胞壁的代谢；( 3 ) 对害虫和病原体的防御：( 4 ) 对有害代谢物的解毒；( 5 ) 果实的成熟；( 6 ) 香气形成【7 2 7 4 1 。 1 3 葡萄糖苷酶可水解结合于末端、非还原性的1 3 一d 糖苷键，同时释放1 3 d 一葡萄糖和相应配基。此外，还能微弱地水解对硝基1 3 d 一半乳糖苷和1 3 d 木糖苷。在微生物领域，b 葡萄糖苷酶是一种很重要的纤维素酶类。纤维素酶类包括内切1 3f 1 ， 4 ) 葡聚糖酶，外切1 3 ( 1 ，4 ) 葡聚糖酶和1 3 葡萄糖苷酶。此三种酶类先后作用，共同将纤维素水解成葡萄糖。在纤维素的糖化作用中，1 5 葡萄糖苷酶功能是将纤维素二糖和纤维素寡糖水解成葡萄糖，其中1 5 葡萄糖苷酶强烈地影响纤维素的水解速度。葡萄糖对酶有着强烈的底物抑制。近年来，许多学者一直从事着这方面的研究，己成功地从动物、植物、微生物中分离、纯化和鉴定出高活力、低底物抑制作用的b 葡萄糖苷酶，并进行了广泛的酶学性质研究i 6 0 - 8 1 。酶基因的克隆、测序及其表达也有很多的报道【7 5 。7 0 。最早对1 3 葡萄糖苷酶基因克隆与表达的研究是在微生物体中。现1 5 葡萄糖苷酶基因已从燕麦1 7 8 】、蜀黍1 7 9 l 、旱金莲l “i 、长春花1 8 l 】肄植物中进行了克隆和表达。 2 1b 一葡萄糖苷酶与醇系香气形成关系的研究现状二十世纪七十年代是水果风味化学研究的发展时期，随着对水果香味形成机理研究的深入，人们开始研究风味物质在水果中存在的前体一一些二级代谢产物，如糖苷物质。法国的c o r d o n n i e ra n db a y o n o v e l 2 0 1 1 9 7 4 年首次提出葡萄中可能存在键合态的萜烯类化合物，并以糖苷形式存在。香气前体领域的研究近几年进展很快，并迅速延伸到其他水果、鲜花【9 1 1 甚至农作物中。这些研究结果足以说明，以单萜烯醇和芳香族醇为主的挥发性物质在植物体内以键合态糖苷的形式存在，并在内源8 一葡萄糖苷酶的作用下或是在特定条件下( 如失水、虫咬等，水解并释放出配基，释放出香气。这一植物界普遍存在的生命现象，在茶树【船l 、茉莉花1 8 38 4 1 、栀子花【8 2 l 上也得到了广泛深入的研究。 2 1 1 茶叶中1 3 葡萄糖苷酶与醇系香气关系的研究国外学者较早发现茶叶醇系香气与糖苷酶作用有关。1 9 8 1 年t a k e ot 1 吲首次将茶鲜叶匀浆物置4 0 下培养3 0 m i n 后发现有大量的香气物质芳香醇和香叶醇的产生，当加入1 3 葡萄糖苷酶的抑制剂h 9 2 + 及特异性抑制剂葡萄糖酸1 ，4 - 内酯后，芳樟醇和香叶醇的生成受阻，因此推测茶叶中的芳樟醇和香叶醇的形成与内源b 一葡萄糖苷酶有关。这是香气研究的起始。f i s c h e rn 1 2 1 】用外源8 葡萄糖苷酶及果胶酶使红、绿茶产生大量香气物质，迸一步证明1 3 葡萄糖苷酶能促使茶叶香气物质的释放。 y a n om 【9 3 1 以对硝基1 3 d 葡萄糖营( p n p g ) 为底物，首次证实了新鲜茶叶中b 葡萄糖昔酶的活性，进一步支持了t a k e ot 的推论。之后，s a k a t ak 等【舛】将茶鲜叶粗酶提取物进行纯化，得到1 3 一d 半乳糖苷酶和b d 葡萄糖苷酶，更加有力地证明了茶叶中存在参与香气释放的b 一葡萄糖苷酶。但是目前尚未有直接证据证明b 半乳糖苷酶参与了茶叶的香气释放，也没有发现以半乳糖为糖基的香气前体。由此可见，b 葡萄糖营酶与茶叶醇系香气形成有着直接关系。在此基础上，国内学者侧重于研究茶叶1 3 葡萄糖苷酶的提取和活性测定方法、加工工艺和茶叶品种酶活性的变化，分析酶与茶叶品质的关系。如王华夫、游小青【2 2 】对茶叶中b 葡萄糖苷酶活性测定方法进行了研究。骆耀平等1 冽比较七个茶树品种新稍生育过程中b 葡萄糖苷酶的活性，发现品种间1 3 葡萄糖苷酶活性差异甚大，高低之差高达3 - 4 倍。且各品种酶活性均表现为秋季最高，夏季次之，春季最低。夏涛等【2 9 】对红茶萎凋、发酵过程中1 3 葡萄糖苷酶活性变化研究表明，低温萎凋与发酵有利于酶活性的提高和香气的形成。赵芹等【5 9 】人就施肥对茶鲜叶b 葡萄糖苷酶活性及醇系香气的研究表明，施用有机肥和大棚覆盖有利于增强酶的活性，结合态醇系香气含量与醇系香气的总量对生态因子的反应具有协同效应，结合态香气是醇系香气的主要来源。李叶云1 5 8 】电泳测得茶树中1 3 葡萄糖苷酶的亚基分子量为4 1 k d a ， f p l c 测得酶分子量为3 4 k d a 。 2 1 2 某些花中1 3 葡萄糖苷酶与醇系香气关系的研究花中醇系香气形成机理的研究起步较晚，主要集中在栀子花和茉莉花上。已有研究表明，茉莉花香气成分是通过结合态糖苷形式的前体物质在水解酶的作用下逐步释放的，而1 3 一葡萄糖苷酶在这个过程中起着重大作用。到目前为止，己确定的茉莉花香气成分已达4 8 种之多，其中含量较高的芳樟醇及其氧化物、石竹烯等香气的生成重要依赖1 3 d 葡萄糖苷酶的催化作用。w a t a n b en 、m o o n 8 2 】等对荣莉花中香气糖苷前体及释放酶的变化动态展开了研究，表明苯甲醇、2 苯乙醇、芳樟醇、顺一3 一己烯醇以及邻氨基苯甲酸甲酯等香气主要以葡萄糖苷、樱草糖苷、芸香苷等单糖或双糖前体形式存在于茉莉花苞中。并认为b d 葡萄糖苷是茉莉花醇系香气的一类前体物质，在b d 葡萄糖苷酶作用下释放出香气成分。1 9 9 9 年，j a e h a km o o n l 8 4 】从茉莉花中分离出芳樟醇1 3 d 吡喃型葡萄糖苷及它的6 0 丙二酸酯，在b 一葡萄糖苷酶作用下水解两者都能生成芳樟醇。董尚胜i ”】等人研究发现茉莉花初开花时的1 3 d 葡萄糖苷酶活性最高，其前后阶段酶活性低，这些均与茉莉花释放香气规律一致，说明酶活性与香气形成释放有着内在的联系。1 9 9 9 年董尚胜等【2 6 l 对粗香气前体物质生成芳樟醇的主要部分酶蛋白进一步经等电电泳、b d - 葡萄糖苷酶活性染色等电电泳和s d s p a g e 凝胶电泳，初步判断1 3 d 葡萄糖苷酶参与了芳樟醇的生成，且该酶的等电点在8 7 9 0 ，其单体蛋白的分子量在3 5 3 8 k d 之间。迄今为止，已从栀子花中分离到的醇系香气前体物质有2 苯乙醇樱草糖苷、莰醇樱草糖苷、芳樟醇一巢菜糖苷。董尚胜1 3 0 l 等人的研究表明，栀子花香气前提物含量与香气催化酶活性均从蕾期的低水平骤增至初开时的最高峰，随后酶活性迅速下降，而香气前体物的含量仍维持较高的水平，直至花完全开放。通过比较五种糖苷酶活性在开花过程的变化规律，发现b 葡萄糖苷酶的活性变化最接近于香气释放的规律。由此可见，b 葡萄糖苷酶在茶叶、茉莉花、栀予花醇系香气形成中起着重要的作用。目前，关于蜡梅香气形成机理的研究国内外尚未见到相关报导，尚处于空白阶段。以上的这些研究工作对蜡梅花中的1 3 葡萄糖苷酶的研究提供了有价值的参考。 31 3 葡萄糖苷酶的分离纯化由于1 3 葡萄糖苷酶的来源不同，性质差异很大，因此，不可能有一个固定的程序适合各种不同体系中b 葡萄糖苷酶的分离纯化。但多数分离工作中的关键部分、基本手段还是共同的。分离的第一步是细胞的破碎，从细胞内释放出内含物。第二步常常是用离心法将细胞的亚细胞颗粒( 如核、线粒体、微粒体或核糖体等) 与溶液分开。然后就可以采用几种溶解度分级法进行初步分离，再进一步纯化。 0 葡萄糖苷酶一般采用离子交换层析结合分子筛层析的方法来进行分级。如宛晓春1 5 4 j 等人用d e a e s e p h a d e xa 5 0 和s e p h a d e xg 1 0 0 对黑曲霉中的b 葡萄糖苷酶进行纯化。张酷【1 5 j 等采用葡聚糖凝s e p h a d e xg 2 0 0 和i d e a e s e p h a d e xa 一5 0 柱层析纯化福寿螺中b 葡萄糖苷酶，获得经s d s 一聚丙烯酰胺凝胶电泳纯度鉴定的酶。 c a m e l a 【6 9 l 等人用qh y p e r d t m2 0 离子交换层析柱和t s k2 0 0 0 分子筛从樱桃中分离得到了b 葡萄糖替酶。董尚胜i 驯等人采用c m - 1 o y o p e a r l6 5 0 m ； 1 f p l cc m t o y o p e a r l 6 5 0 s 对茉莉花中的b d 葡萄糖苷酶进行纯化。 3 1 离子交换层析离子交换色谱( i o ne x c h a n g ec h r o m a t o g r a p h y , 简写i e c ) 已经被生物化学家们使用很多年了，至今仍被广泛地应用着。作为分离纯化酶的方法之一，离子交换色谱法的优点主要在于它的介质材料、含盐的缓冲流动相系统所构成的环境十分类似于酶稳定存在的生理条件，有利于保持活性和提高回收率，已经成为蛋白质、多肽、核酸及大部分发酵产物分离纯化的一种重要手段。随着生命科学的进一步发展，离子交换色谱在分离和制备酶、活性蛋白质、多肽等生物活性分子上将进一步发挥巨大的作用。 3 1 1 工作原理离子交换法是通过带电的溶质分子与离子交换剂中可交换的离子进行交换而达到分离的一种方法。该法主要依赖电荷间的相互作用，利用带电分子中电荷的微小差异而进行分离，具有较高的分离容量。功能基由固定在骨架上的带电基团与可进行交换的能移动离子两部分组成，二者所带电荷相反，以静电力结合。可进行交换的离子称为反粒子或抗衡离子，这种反离子可与溶液中带同种电荷的离子进行交换反应。因离子交换反应是可逆的，在一定条件下被交换的离子可以“解吸”，使离子交换剂又恢复到原来的形式。所以，离子交换剂通过交换和再生可以反复使用。几乎所有的生物大分子都是极性的，都可以通过改变环境使其带电，从而达到分离作用。选择适当条件使一些溶质分子变成离子态，通过静电作用结合到离子交换剂上，而另一些物质不能被交换，两类物质即可被分离。带同种电荷的不同离子虽然都可以结合到同一介质上，但由于带电量的差异，与介质的结合牢固程度不同，调整洗脱条件就可以将它们进行分离。 3 1 2 离子交换层析条件的选择离子交换剂分为两大类。能与阳离子进行交换的称为阳离子交换剂，能与阴离子交换的称为阴离子交换剂。蛋白质处于等电点时，其宏观带电荷为零，不能进行离子交换，当工作液的p h 值改变时，蛋白质可以带上不同种类和数量的电荷进行离子交换。如果蛋白质在低于等电点的p h 值范围内稳定，带正电荷，则与阳离子交换剂进行交换反应。如果蛋白质在高于等电点的p h 值范围内稳定，则与阴离子交换剂反应。若蛋白质在高于和低于等电点的p h 值范围内都稳定，则既可用阳离子交换剂，也可用阴离子交换剂，此时取决于工作液的p h 值和杂质离子的带电性质。影响分离效果的条件还包括柱长、流速和洗脱液的p h 值。柱长对离子交换色谱分离蛋白质的分离度的影响是很小的。短柱分离较长柱分离更有利。洗脱液的流速一般来说以慢为好，但太慢时存在分离时间长、色谱带扩散等缺陷，因而选择流 9 速时需要进行长期的摸索。利用离子交换色谱分离蛋白质最基本的就是调节p h 值来控制蛋白质的电荷。相对而言，洗脱液p h 值是一个更重要的操作参数，对保留行为、分离度、回收率都有重要的影响陋5 7 1 。 3 2 防止分离纯化过程中蛋白质失活的措施 3 2 1 添加蛋白质稳定剂糖类、多元醇、氨基酸及其衍生物、无机盐、甘油、多聚物( 如p e g ) 一般被称为蛋白质的共溶剂。近几年来的研究表明，共溶剂对蛋白质的保护机制实际上是改变了溶液的热力学性质，使天然蛋白质的稳定性得到了增强，理论上称为优先排阻作用。糖类是蛋白质在溶液和干燥状态下最好的稳定剂i ”l 。甘油和多元醇还能诱导蛋白亚基的自我聚合，并具有减轻器壁吸附和防冻的作用【鹌j 。氨基酸和盐由于其离子化特性，容易与蛋白质产生静电相互作用，需要慎重使用。聚乙二醇( p e g ) 由于具有疏水性及亲水性双重性质，较适合于稳定分散状态的非均质蛋白质。除了共溶剂作为蛋白质的稳定剂外，还需要抗氧化的保护剂。包括抗氧化剂、金属鳌合剂和其他一些试剂。抗氧化剂的选择需根据所涉及的氧化机制来定。当蛋白质溶液中存在痕量的金属离子时，抗氧化剂的添加不仅不能阻止蛋白质的氧化，反而加速了氧化反应。实验中常用的鳌合剂e d t a 、柠檬酸、许多氨基酸、弱磷酸和酒石酸等，都能有效地除去催化氧化的金属离子。在特殊情况下，如e d t a 、f e “ 则会加速氧化反应【5 7 l 。此外，高浓度的糖类及多元醇都能有效地防止氧化，溶液脱气也是防氧化的一个有效措施。 3 2 2 优化操作条件提供温和的操作条件。极端p h 、温度和有机溶剂是蛋白质变性的主要原因，在实验中需对目标蛋白的稳定条件进行摸索，提供适合酶纯化的操作条件。此外，尽量避免蛋白酶的水解和微生物污染。低温操作是减少蛋白酶水解的有效措施，也可以加入一些蛋白酶抑制剂。溶酶体是蛋白酶的主要来源，在有这类细胞器存在时，加入蔗糖或甘露糖能稳定溶酶体膜并减少蛋白酶的释放。在防止蛋白酶水解的同时，应注意防止微生物的污染，因为许多蛋白酶是由微生物产生的。微生物的污染还会带进一些甚至是毒素类的物质。在提纯过程中可通过过滤来除菌或在低温下操作以抑制微生物的生长。添加抑菌剂也是可行的，但在使用时需十分谨慎，因为某些抑菌剂能修饰蛋白而使其丧失活性。 3 2 3 减少纯化步骤减少纯化步骤是降低成本，减少环境因素造成不利影响的有效措施。利用已有 1 0 的和新近开发的生化分离技术将纯化过程的有关环节进行合理的组合，使分离工艺简单、快速，各步骤之问紧密联系。 41 3 。葡萄糖苷酶的理化性质 4 1 分子量 1 3 ，葡萄糖苷酶的相对分子质量一般在4 0 3 0 0 k d a 之间。不同来源酶的相对分子量由于其结构和组成不同而差异很大。如汪大受等1 1 1 】从康氏木霉培养液中分离提纯了b 葡萄糖苷酶，测得其分子量为7 7 0 0 0 ：而王沁【1 2 j 从黑曲霉发酵液中分离提纯了该酶，共得到4 种酶组分，经凝胶电泳鉴定均为单一谱带，且其分子量分别为 7 7 0 0 0 、6 7 0 0 0 、7 3 0 0 0 、4 3 0 0 0 。宛晓春i l o l 从黑曲霉中纯化的酶用s d s 凝胶电泳和凝胶过滤测得该分子量在1 2 0 0 0 0 左右；陈向东研究日本根霉i f 0 5 3 1 8 中的6 葡萄糖苷酶是一种四聚体，由四个分子量为1 o 1 0 5 的相同大小的亚基组成。d a y “瞎人从a g r o b a c t e r i u m 中分离出的b 葡萄糖苷酶是一种二聚体，单体分子量为5 0 k d 。从樱桃果实中分离的一葡萄糖苷酶是一种分子量为6 8 0 0 0 左右的单体蛋白【6 9 】。黑麦秧苗中的0 葡萄糖苷酶是一全酶，分子量为3 0 0 0 0 0 ，是由分子量为6 0 0 0 0 的单体所组成低聚体1 7 。 4 2 最适p h 及p h 稳定性大部分b 葡萄糖苷酶均为酸性蛋白，等电点在酸性范围，并且变化不大，一般在3 5 5 5 之间，最适p h 大都在酸性范围内【1 0 。1 5 、6 9 7 0 1 ，但也可以超过7 0 ，而且酸碱耐受性强。如p a a v i l a i n e n l l 4 】等人从a 1 k a l 叩h i l u s 中就分离出细胞外b 葡萄糖苷酶，其最适p h 就在6 - 9 之问，而在p h 4 0 - 4 0 2 以外还具有一定的催化活性。 4 - 3 最适温度及热稳定性 b 葡萄糖苷酶的最适温度分布在3 0 1 1 0 。一般来说，来自古细菌的b 一葡萄糖苷酶其热稳定性和最适温度要高于普通来源的葡萄糖苷酶。如古细菌p y r o c o c c u s f u r i o s u s 的1 3 葡萄糖苷酶的最适温度1 0 2 1 0 5 c ，1 0 0 【2 时的半衰期为8 5 h “】。 4 4 底物专一性几乎所有的b 葡萄糖苷酶对底物糖基结构的专一性都较差，能袭解c - s 键、 c n 键、c - f 键等；但有些对糖基部分的c 4 和c 2 结构并不专一，能同时水解b 葡萄糖苷键和b 半乳糖苷糖，有些甚至c 。位的专一性也不高，能水解木糖 1 4 l 。但在所有底物中，b 葡萄糖苷酶对纤维二糖的活性最强，对人工合成的底物对一硝基苯一b - d 葡萄糖苷( p n p g ) 表现出较高的酶活性【3 6 。4 “。 4 5 金属离子、抑制剂葡萄糖是1 3 。葡萄糖苷酶的典型抑制剂，8 葡萄糖酸内脂、对氯高汞苯甲酸、异丙基b d 硫代葡萄糖苷对一定来源的酶表现出