低温胁迫对苔藓植物地钱黄酮类化合物含量及相关酶活性的影响
摘要：为了研究低温对于地钱总黄酮类化合物累积量的影响，以及低温条件处理前后合成黄酮化合物关键酶苯丙氨酸解氨酶活力的动态变化。采用超声波辅助乙醇浸提法从地钱中提取黄酮类物质，并用分光光度法测定总黄酮类化合物含量。通过L-苯丙氨酸法对低温处理前后的地钱中的苯丙氨酸解氨酶进行提取并测定其活力。
关键词：地钱；黄酮化合物；苯丙氨酸解氨酶; 低温
一、文献综述
背景苔藓植物是植物界中的一个重要门类,属于低等植物,约占全世界植物总数的5%。从分类学角度可将苔藓植物分为三类:角苔纲、苔纲、藓纲。大约在300万年前,地球上就有了苔藓,比有花植物早了约200万年［1］。苔藓是光合生物从水生环境到陆生环境进化过程中出现的过渡型植物，在进化中获得了一套独特的感受各种环境胁迫的分子机构，使其拥有更广泛的适应性和变异能力。苔藓分布很广,能适应多种气候环境,世界各处几乎都有分布,尤其多生于阴暗潮湿地区,如热带雨林和山林,特别是土坡、沟边或沼泽地等。苔藓植物虽然分布面积较广,但密度较小,种间杂生,不易区别和分离,难以大量采集,对其进行化学成分的研究长期受到忽视,直到近30年来,随着分析仪器精密性越来越好,分析技术不断进步,测定一个天然产物的结构所需要的量越来越少,苔藓植物化学成分的研究才取得一定进展。许多研究结果表明,苔藓植物中具有许多新颖的结架,含有不少生物活性成分。可将苔藓植物称为是具有潜力的天然产物的宝库。
地钱是地钱科、地钱属。苔鲜植物门的叶状体苔类，广泛分布于各地,多生长于阴暗潮湿的地方。药用始载于《名医别录》,《本草纲目》中谓之“石衣”,味淡,性凉,归肝经。清热利湿,解毒敛疮。地钱的化学成分主要包括香豆素类、联苄类化合物和黄酮类化合物等，其中黄酮类化合物是参与植物发育和防御的次生代谢产物，因其具有抗氧化、清除自由基、抑菌等多种功能而受到广泛关注，对人类健康有重要意义。黄酮类化合物具有结构和特征多样性，其化合物基本骨架为C6-C3-C6，两个苯环通过三个碳原子结合而成，根据分子结构可分为6大类，包括黄酮类、黄酮醇类、黄烷酮类、异类黄酮类、黄烷醇类、花色素类等。黄酮化合物普遍存在于植物体内的生物合成途径当中，并产生及其丰富的次生代谢产物，是次生代谢产物中最大的类群之一，是植物色素的主要来源，在植物的各个部位都有积累。发育阶段的早晚和环境温度、湿度的强弱对类黄酮在植物中积累的影响有所不同。
（二）国内外研究现状综述
目前对苔藓植物中的苔纲类研究最多。地钱是苔纲的代表植物,它是苔纲类植物中形态构造最复杂、进化程度最高等的种类。目前国外有部分植物学家、化学家和药学工作者已对地钱进行了一定研究；我国中山大学、山东医科大学也有部分学者对苔藓及地钱化学活性进行研究,并取得一定进展。根据国内研究学者的研究成果来看，地钱具有多种生物活性物质，所具有的药用价值应引起生物学家、植物化学家、药物化学家等的广泛重视。对地钱所含的化学成分分析，为研究低温胁迫对地钱黄酮类化合物提供了一定理论基础。
但国内外对其独特的低温胁迫感受的研究仍处于起步阶段。国内暂未有关于低温胁迫对苔藓植物地钱黄酮类化合物含量及其相关酶活性的影响。国外有关于温度和光照条件对部分植物中黄酮类物质生物合成及相关基因表达水平的影响的研究。在国外研究中表明，温度是黄酮类化合物的合成过程中关键的影响因素之一，在Akifumi［2］等的研究中，发现葡萄皮中的黄酮类化合物受到温度和光照的影响。此外，大量研究证实苯丙氨酸解氨酶（PAL）、肉桂酸4-羟基化酶（C4H），４－香豆酸辅酶Ａ连接酶（4CL）是苯丙烷类代谢途径的3个关键酶。Brossa等[17]研究圣栎在夏季和冬季时的类黄酮含量，发现冬季圣栎中的黄酮醇、槲皮黄酮、山奈酚等成分含量更高，并且温度越低，黄酮积累量更多。Wang等[18]通过研究温度对银杏叶黄酮量的影响发现在15℃的低温下，PAL、C4H及4CL等酶的活性较强，银杏叶中总黄酮量较高。随着物化学与分子生物学的快速发展，植物黄酮化合物合成途径、环境因子对化合物积累的调控、合成途径中关键酶基因的克隆及表达等方向逐渐受到科研工作者的青睐并且也取得了成果，这对于研究低温对其黄酮化合物合成途经中影响的关键酶活性提供了理论依据。目前关于植物生命过程中苯丙氨酸解氨酶的研究较多，多是针对酶分离、纯化和基本性质的研究，如陈东来迅等［19］对铁皮石斛苯丙氨酸解氨酶进行分离及纯化研究，张晨等［20］通过对毛果杨苯丙氨酸解氨酶进行分离纯化及代谢途径的研究，姚军等［21］研究采后水杨酸处理对哈密瓜苯丙氨酸解氨酶的基本性质研究，王军等［22］研究燕麦苯丙氨酸解氨酶的分离纯化及性质，但关于鉴定苯丙氨酸解氨酶在低温条件下酶活力变化的研究较少。
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