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Identification of heat stress transcription factors gene family in Setcreasea purpurea and analysis of its expression pattern under Cu2+ stress

来源：花匠小妙招时间：2025-01-08 09:51

摘要：热激转录因子(Hsf) 是植物中最重要的转录因子家族之一，在植物遭遇热、干旱和重金属等多种非生物胁迫中具有重要的作用。为明确紫鸭跖草Hsf基因家族的结构及功能，从紫鸭跖草全长转录组数据库筛选鉴定出20个SpbHsf基因，并运用生物信息学工具和qRT-PCR进行分析。结果显示：SpbHsf蛋白均为亲水性蛋白，定位于细胞核的SpbHsf蛋白有12个，所有SpbHsf蛋白二级结构的α螺旋和无规卷曲的含量较高。SpbHsf基因分为3个亚族，各亚族都包含独特的保守基序。全部SpbHsf蛋白含有DBD和HR-A/B结构域。系统进化分析显示，与SpbHsf蛋白同源性最高的是水稻OsHsf蛋白。20个SpbHsf基因在紫鸭跖草根组织中均有表达。相比于对照组，根组织在Cu2+胁迫下，8个SpbHsf基因的表达量显著上调，8个SpbHsf基因的表达量显著下调。研究结果为紫鸭跖草Hsf基因家族的功能验证及表达模式提供了一定的理论参考。

Abstract: Heat stress transcription factors (Hsf) family is one of the most important transcription factor families in plants, and plays an important role in the growth and development of plants when encountering abiotic stresses such as heat, drought, and heavy metals. In this study, 20 SpbHsf genes were identified from the full-length transcriptome database of Setcreasea purpurea, and the structure and function of the Hsf gene family were analyzed using bioinformatics tools and qRT-PCR. The results showed that all SpbHsf proteins were hydrophilic. There were 12 SpbHsf proteins located in the nucleus, and the content of α-helix and random coil in the secondary structure of all SpbHsf proteins was high. The SpbHsf genes are divided into three subfamilies, each of which contains unique conserved motifs. All SpbHsf proteins contain DBD and HR-A/B domains. Phylogenetic analysis showed that OsHsf in Oryza sativa protein had the highest homology with SpbHsf protein. All the 20 SpbHsf genes were expressed in the root tissues of S. purpurea. Among them, 8 were significantly up-regulated while 8 were significantly down-regulated under Cu2+ stress. This study may help better understand the function and expression pattern of the S. purpurea Hsf gene family.

热激转录因子(heat stress transcription factors, Hsf)，是介导对热或其他应激反应基因激活的信号转导链的末端元件，被认为是调控热激蛋白(heat shock proteins, Hsps) 表达的主要转录调节因子[1]。在正常生长条件下，热休克蛋白大多数充当分子伴侣，Hsf基因通过与Hsp70等分子伴侣的结合保持在惰性单体状态。在发生应激反应时，Hsf基因能调控热休克蛋白表达，Hsps能够阻止蛋白质解体和聚集，从而维持细胞内蛋白质的稳态、保护细胞结构和调节应激反应的功能。与许多其他转录因子类似，Hsf基因家族在进化上十分保守。Hsf蛋白由多个结构和功能保守域组成，包括DNA结合域(DNA binding domain, DBD)、核输出信号(nuclear export signal, NES)、寡聚化结构域(oligomerization domam, OD)、C端转录激活结构域(carboxy-terminal domain, CTD)、核定位信号(nuclear localization signal, NLS) 和抑制蛋白结构域(repression domain, RD)[2]。在这些保守结构域中，N末端的高度结构化的DNA结合域是Hsf蛋白最保守的基序，由4个β-折叠(β1、β2、β3、β4) 和3个α-螺旋(α1、α2、α3) 组成。该结合域的疏水核心形成一个特定螺旋-转角-螺旋(α1-β1-β2-α2-α3-β3-β4) 结构，能特异性地识别并结合靶基因的热休克元件的保守基序，进而激活抗逆基因的转录和表达[3]。OD结构域是2个以疏水性氨基酸残基(七肽重复区域) 结合的HR-A/B部位构成的，后者通过可变长度柔性连接体(约15–80个氨基酸) 连接到DBD[4]。根据DBD距离OD的长度以及HR–A/B的残基数量，可将Hsf基因家族分为3组：A、B和C。A类可细分为9个子类：A1–A9；B类分为4个子类：B1–B4；而C类只有2个子类：C1和C2[5-7]。

尽管Hsf基因家族在进化上十分保守，但Hsf基因家族在数量上却存在差异。现今已从许多物种中鉴定出Hsf基因家族成员，例如拟南芥Arabidopsis thaliana中鉴定出22个、水稻Oryza sativa中鉴定出25个、紫花苜蓿Medicago truncatula中鉴定出16个、毛果杨Populus trichocarpa中鉴定出28个、陆地棉Gossypium hirsutum和小麦Triticum aestivum中分别鉴定出40个和56个成员等[8]。迄今为止，在甘蓝型油菜Populus trichocarpa中鉴定出Hsf基因家族包含的基因最多，有64个Hsf基因成员[9]。近年研究发现，许多Hsf基因成员在不同物种中应对各种胁迫反应的生物学功能不断被证实。例如，在对拟南芥HsfA2亚类基因敲除突变和过表达分析中，发现该亚家族基因参与了热激、强光、氧化应激和缺氧等多种胁迫反应[10]，HsfA3亚类也参与了受热、干旱胁迫反应[11]。向日葵Helianthus annuus HsfA4a和HsfA9基因在烟草中的共表达可以提高幼苗对严重脱水和氧化胁迫的抗性[12]；镉超积累型东南景天Sedum alfredii基因SaHsfA4ah和SaHsfA4ch的异源表达可以增强酵母对Cd的耐受性[13]。

紫鸭跖草Setcreasea purpurea B.K.Boom又名紫锦草，是一种多年生草本植物，具有较高的观赏价值。紫鸭跖草是一种超积累铜植物[14]，耐受铜离子的能力强于其他普通植物，在修复铜污染的土地具有一定的潜力。目前尚未有对紫鸭跖草的Hsf基因的报道，本研究从紫鸭跖草转录组测序的GO富集和KEGG通路中，通过基因的注释和阈值P≤0.001的过滤，筛选与铜诱导相关且在300 µmol/L Cu2+胁迫组和1 000 µmol/L Cu2+胁迫组均有显著性上调表达的基因。发现SpbHsfA3基因和SpbHsfB2b基因显著上调表达，说明Hsf基因家族成员在受铜胁迫时可能发挥关键作用。本研究从紫鸭跖草的转录组数据库中筛选鉴定出Hsf基因家族成员，并对其进行生物信息学分析和Cu2+胁迫下的表达模式分析，从而获得潜在的铜离子胁迫表达基因。

1 材料与方法1.1 数据库与试验材料

本研究以紫鸭跖草根组织在Cu2+ (0.25、100、300 µmol/L) 胁迫下的全长转录组测序所得的数据(NCBI的SRA数据库，登录号为SAMN11265427)，筛选和鉴定出紫鸭跖草的Hsf基因家族成员。

剪取紫鸭跖草4–6 cm的嫩茎，置于培养箱中的Hoagland's (霍格兰氏) 营养液中培养，培养箱昼夜温度为(25±1) ℃/ (20±1) ℃，光周期为14 h光照/10 h黑暗，光照强度为300 μmol/(m2·s)。待培养30 d后嫩根长成，依次在0.25 (对照组)、100、300、1 000 μmol/L Cu2+的Hoagland's营养液中培养4 d，以各Cu2+营养液培养紫鸭跖草的根为qRT-PCR分析试验材料，取样后迅速用液氮冷冻并放置−80 ℃冰箱保存。

1.2 紫鸭跖草Hsf基因家族成员的鉴定

通过本地BLAST程序和Hmmer程序共同检索紫鸭跖草全长转录组数据库(本课题组转录组数据库) 中的Hsf基因：(1) 利用本地BLAST程序，以已知的Hsf基因DBD保守结构域的氨基酸序列为查询序列，运用BLASTp搜索本地紫鸭跖草转录组数据库的蛋白序列库中的同源基因，筛选阈值：E < 10–5，得到潜在的SpbHsf基因序列。(2) 利用Hmmer程序，以Hsf基因的隐马尔可夫模型(Pfam：PF0047) 在紫鸭跖草转录组测序的蛋白质序列库中进行搜索，筛选E < 0.000 1且编码氨基酸长度大于100的序列作为潜在的Hsf基因。合并两个程序搜索的序列数据，再通过Pfam数据库和在线SMART程序验证所有候选Hsf蛋白序列是否包含Hsf型DBD结构域。由于转录组测序获得的部分unigene所包含的编码区信息不完整，因此利用在线BLASTP分析和SMART分析对初步筛选的紫鸭跖草Hsf基因家族成员进行鉴定分析。对于编码序列不完整的基因成员，委托生工生物工程(上海) 股份有限公司利用同源克隆的方法进行补足。

1.3 SpbHsf蛋白理化性质及结构的分析

运用ExPASy在线软件(https://web.expasy.org/protparam/) 分析SpbHsf蛋白的分子质量、等电点、平均疏水性和不稳定指数等理化性质；运用Prabi在线软件(https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=/NPSA/npsa_sopma.html) 预测SpbHsf蛋白的二级结构；运用Swiss-Model在线软件(https://swissmodel.expasy.org/interactive) 预测SpbHsf蛋白的三级结构；运用PSOR在线软件(http://psort1.hgc.jp/form.html) 分析SpbHsf蛋白的亚细胞定位。

1.4 SpbHsf基因保守基序的分析

对紫鸭跖草Hsf基因家族各成员，利用Clustal X进行同源性比对，比对结果由GeneDoc编辑。利用在线程序MEME对Hsf基因家族成员进行Motif提取，参数：搜索motif为20个、其他参数不变。利用MEGA7 (neighbour joining法) 软件和在线程序EvolView绘制系统进化树与保守基序组成图。

1.5 SpbHsf蛋白结构域分析

通过在线数据库Heatster，以已鉴定的植物Hsf蛋白结构域为基础分析SpbHsf基因家族成员的保守结构域。再运用MEGA7、GeneDoc软件对SpbHsf蛋白的DBD保守结构域进行聚类分析。

1.6 多物种进化树的构建

在NCBI中检索出22个拟南芥AtHsf蛋白、25个水稻OsHsf蛋白、28个毛果杨PtHsf蛋白和22个东南景天(S. alfredii) SaHsf蛋白，再运用MEGA7软件(neighbour joining法) 将检索出的Hsf蛋白与SpbHsf蛋白共同构建系统进化树，再通过EvolView在线软件对其进行美化。

1.7 qRT-PCR分析SpbHsf基因的表达

运用Primer Premier 5软件设计SpbHsf基因的特异性引物(表 1)，选取泛素连接酶(UBI)基因(UBI-F：5′-AGCACTCTTCACCTCGTCC-3′；UBI-R：5′-CTTCGCCTTCACATTCTC-3′) 作为荧光定量qRT-PCR分析的内参基因，运用qRT-PCR分析紫鸭跖草根组织中20个SpbHsf基因的表达模式。运用qRT-PCR分析不同Cu2+浓度胁迫下紫鸭跖草根各Hsf基因表达不同组织(根、茎、叶) 的SpbHsf基因表达量，利用实时荧光定量仪LightCycler480 System进行反应，每个反应进行3次生物学重复，运用2–∆∆Ct法计算基因的相对表达量。采用SPSS 25.0软件对数据进行统计分析，均值间比较采用Duncan's法(P < 0.05)。

表 1 SpbHsfs基因家族的引物设计Table 1 Primers used for amplification of SpbHsfs gene family

Names Primer sequences Tm (℃) Length (bp) Former primers Reverse primers SpbHsfA1a CGAGGTTGGTAGTGGCAGTG ACGCCCGAGCCTCAAGT 58/60 186 SpbHsfA1b AGAAACTCAACAAGGCGTAA CGGAAGGCTCGTAGGTAG 57/60 156 SpbHsfA1d AGAACGCACGGCTCACC CATCGCCAGGCTTTACG 60/60 178 SpbHsfA2b AAAGGCTCAACCACATAA TTCCCAAGGTCTTCAACT 60/59 134 SpbHsfA3 AATTTCTCCAGTTTCGTC TTATGTGGTTGAGCCTTC 60/60 169 SpbHsfA5 CTGGTGGCAATGCTGAT GCAAACCTCCCTGACTT 60/57 202 SpbHsfA6 GTGATGCCTGACCTGTGG CAATGCTGGTGATGAAGT 60/60 142 SpbHsfA4c CCACCTGCATTCCCTTTA TCGTTGTCTTCTGCGTTG 56/60 106 SpbHsfA4b ATTAGAAGTGTTAGCCAAGC GTAGCCAACTCCGTGATT 58/58 159 SpbHsfA4a CCATTATCCAGCAAAGAA CTGCCTGAACAAAGACATTA 60/60 123 SpbHsfB1b CCCGATAGGTGGGAGTTT ATGTGGTGAGCCGTTTGT 58/59 225 SpbHsfB1c CACCAATGCCACAGTCCC CCAAGCAGTTCGTCGTAG 60/60 101 SpbHsfB1a GGGGAACAACAGGGACTT CACTTTGCGGAAACCATA 59/59 146 SpbHsfB2b CAGACCACAGCAACCCAC AACCTCCAGCAGAGCAGA 60/60 134 SpbHsfB2a TCGCCAGCTCAACACTTA TTCTTTCCATTCCCTCCA 60/58 156 SpbHsfB4b CGAGTTACAAACGCATACA AAGGAGGACTTCTGAACCAT 60/61 152 SpbHsfC1b TCACTGCGTTTACAAGAAT AAGTAGTCGGCGGATAAG 60/60 112 SpbHsfC1a TTATGGATTTAGGAAGGTGGAT CGCCGAACAATGAGATGA 60/60 108 SpbHsfC2b GCCACCTGCTCCTCCATA CTGCCATCAATACTTGCTTA 60/60 189 SpbHsfC2c TCACTGCGTTTACAAGAAT AAGTAGACGGCGGATAAG 60/60 201

2 结果与分析2.1 SpbHsf基因鉴定结果与理化性质

运用本地BLAST程序和Hmmer程序检索、Pfam数据库和在线SMART程序验证、同源克隆，最后获得20个紫鸭跖草Hsf基因家族成员，将20个SpbHsf基因在NCBI上进行注释，发现大部分与水稻Hsf基因有较高的同源性，故将各基因成员根据水稻直系同源基因进行命名(表 2)。

表 2 SpbHsf基因的基本信息Table 2 Basic information of SpbHsf gene

Names ORF length(bp) No. of AA Mol Wt pI GRAVY Instability index α-Helix(%) Extended strand(%) β-Tum(%) Random coil(%) Subcellular location(%) SpbHsfA1a 1 452 483 53.50 4.59 –0.496 56.97 33.95 7.45 4.55 54.04 Endoplasmic reticulum SpbHsfA1b 1 464 487 53.84 4.87 –0.547 47.23 31.42 9.24 5.13 54.21 Endoplasmic reticulum SpbHsfA1d 1 524 507 55.32 4.65 –0.487 59.47 35.11 9.07 5.52 50.30 Extracellular SpbHsfA2b 786 261 29.47 4.91 –0.778 37.62 45.59 8.81 8.43 37.16 Nucleus SpbHsfA3 1 491 496 55.36 8.00 –0.513 59.19 37.30 12.50 6.85 43.35 Peroxisome SpbHsfA5 1 371 456 55.40 5.16 –0.662 56.08 35.53 7.02 4.17 53.29 Nucleus SpbHsfA6 969 322 36.82 5.03 –0.681 59.89 55.90 9.94 6.21 27.95 Nucleus SpbHsfA4c 1 026 341 38.40 5.11 –0.730 54.31 46.33 10.56 5.28 37.83 Chloroplast SpbHsfA4b 1 305 434 49.00 5.43 –0.715 57.59 39.17 8.76 3.00 49.08 Nucleus SpbHsfA4a 1 203 400 45.56 5.33 –0.764 53.34 40.00 11.25 3.25 45.50 Nucleus SpbHsfB1b 942 313 35.17 8.56 –0.680 59.73 43.45 9.90 4.15 42.49 Nucleus SpbHsfB1c 903 300 33.52 7.71 –0.584 50.71 42.33 10.33 6.67 40.67 Nucleus SpbHsfB1a 1 020 339 38.31 8.21 –0.615 53.61 46.61 7.96 5.01 40.41 Nucleus SpbHsfB2b 1 065 354 38.57 6.49 0.419 54.80 34.18 9.32 4.24 52.26 Nucleus SpbHsfB2a 10 249 342 37.07 5.36 –0.547 65.25 33.04 8.19 3.51 55.26 Endoplasmic reticulum SpbHsfB4b 1 080 359 39.75 8.21 –0.439 56.16 27.58 15.04 5.29 52.09 Nucleus SpbHsfC1b 645 214 24.70 8.25 –0.489 51.19 49.53 7.01 7.01 36.45 Nucleus SpbHsfC1a 795 265 27.84 4.98 –0.154 47.23 35.85 12.83 9.06 42.26 Endoplasmic reticulum SpbHsfC2b 630 209 23.84 8.94 –0.594 53.89 52.63 9.57 8.61 29.19 Nucleus SpbHsfC2c 705 234 26.26 6.47 –0.525 48.72 51.71 11.54 7.69 29.06 Peroxisome

通过理化性质分析可知：紫鸭跖草20个Hsf基因的编码序列长度在630–1 524 bp之间，编码的蛋白质含209–507个氨基酸，分子量在23.84–55.40 kDa之间；蛋白等电点介于4.59–8.94之间，其中14个SpbHsf蛋白为酸性蛋白，6个SpbHsf蛋白为碱性蛋白，说明SpbHsf蛋白以酸性蛋白为主；蛋白平均疏水性在–0.778至–0.154之间，均为负值，说明SpbHsf蛋白均为亲水性蛋白；蛋白的不稳定指数在37.62–65.25之间，除了SpbHsfA2b蛋白的不稳定指数小于40，为稳定蛋白外，其余SpbHsf蛋白的不稳定指数均大于40，为不稳定蛋白。

2.2 SpbHsf蛋白的结构

Prabi在线软件能预测出SpbHsf蛋白二级结构的α螺旋、延伸链、β转角和无规卷曲4种元件(表 1)，α螺旋(27.58%–55.90%) 和无规卷曲(27.95%–55.26%) 2种结构元件含量显著高于延伸链(7.01%–15.04%) 和β转角(27.95%–55.26%)。紫鸭跖草SpbHsf蛋白三级结构的预测如图 1所示。亚细胞定位分析表明：SpbHsfA3和SpbHsfC2c蛋白定位于过氧化物酶体，SpbHsfA4c定位于叶绿体，SpbHsfA1d蛋白定位于细胞外，SpbHsfA1a、SpbHsfA1b、SpbHsfB2a和SpbHsfC1a蛋白定位于内质网，其余12个SpbHsf蛋白均定位于细胞核，这表明紫鸭跖草的Hsf基因可能在多种细胞结构中具有生物学功能。

图 1 SpbHsf蛋白的三级结构Fig. 1 The tertiary structure of SpbHsf proteins.

2.3 SpbHsf基因的保守基序

SpbHsf基因家族共鉴定出20个motif。通过构建SpbHsf基因的保守基序组成分析图(图 2)，显示出SpbHsf基因被分为A、B、C三个亚族，从SpbHsf基因的保守序列可以看出，所有的SpbHsf基因均含有motif 1和motif 3，从单一亚族来看，motif 8、13、11和19仅存在A类亚族中，motif 10、16仅存在B1亚族中，motif 4仅存在C2亚族中，说明SpbHsf基因在相同亚族中具有一定的保守性。

图 2 SpbHsf基因的保守基序组成分析Fig. 2 The conserved motif composition of SpbHsf genes.

2.4 SpbHsf蛋白的结构域

通过在线数据库Heatster，以已鉴定的植物热激转录因子结构域为基础分析SpbHsf蛋白保守结构域(表 3)。所有的SpbHsf蛋白中均含有DBD和HR-A/B两种保守结构域，AHA和NES结构域仅存在于A类亚家族，RD仅存在于B类亚家族，而C类亚家族三者都不包含。运用MEGA7和GeneDoc 2个软件对这20个SpbHsf蛋白成员的结构域进行聚类分析(图 3)，可知SpbHsf蛋白含有由3个α-螺旋和4个β-折叠构成的DBD结构域[15]，SpbHsf蛋白的DBD结构域由94个氨基酸构成，其中SpbHsf4a蛋白的DBD结构域中缺失β3折叠，可能是本身遗传进化的特性所导致。

表 3 基于Heaster数据库分析的SpbHsf蛋白的结构域定位Table 3 Domain location of SpbHsf proteins based on Heaster database analysis

Names E-value DBD HR-A/B NLS AHA RD NES SpbHsfA1d 7.8e-185 33–128 132–224 226–243 – – 489–503 SpbHsfA1a 3.7e-184 14–109 113–205 207–224 (AHA2) 420–437 – 465–479 SpbHsfA1b 2.9e-206 37–132 139–213 233–250 (AHA2) 455–472 – 475–484 SpbHsfA2b 3.3e-96 53–150 159–173 179–199 (AHA) 224–236 – – SpbHsfA3 7.6e-35 27–112 225–292 361–378 (AHA3) 388–389 – – SpbHsfA5 1.2e-138 17–111 126–205 206–223 (AHA) 415–432 – – SpbHsfA6 4.7e-49 22–117 143–208 255–265 – – – SpbHsfA4c 4.3e-93 21–118 134–213 214–224 (AHA1) 276–288 – 324–338 SpbHsfA4b 2.6e-144 9–104 124–203 207–226 (AHA1) 376–393 – – SpbHsfA4a 3.2e-77 10–105 131–198 203–222 (AHA2) 367–381 – 384–398 SpbHsfB1b 4.2e-96 23–118 160–215 284–289 – 261–269 – SpbHsfB1c 5.2e-95 20–119 166–214 254–263 – 248–256 – SpbHsfB1a 4.7e-86 23–118 191–237 297–306 – 290–299 – SpbHsfB2b 2.0e-144 14–109 171–220 292–300 – 280–288 – SpbHsfB2a 9.0e-126 10–105 163–212 282–289 – 270–278 – SpbHsfB4b 3.7e-141 34–129 195–241 320–326 – 207–316 – SpbHsfC1b 2.1e-96 11–106 129–191 – – – – SpbHsfC1a 6.7e-75 30–125 171–234 – – – – SpbHsfC2a 1.7e-104 13–107 129–185 – – – – SpbHsfC2b 4.9e-111 12–106 127–183 202–209 – – –

图 3 SpbHsf蛋白DBD结构域多序列比对Fig. 3 Multiple sequence alignment of the DBD domain of SpbHsf proteins.

2.5 多物种Hsf蛋白系统进化树分析

为了分析紫鸭跖草Hsf基因家族成员的进化特征，构建了SpbHsf蛋白与拟南芥、水稻、毛果杨和东南景天Hsf蛋白的系统进化树(图 4)，可以看出SpbHsf蛋白总体上被分为A、B、C三类。其中A类包含10个SpbHsf蛋白，B类包含6个SpbHsf蛋白，C类包含4个SpbHsf蛋白。从系统进化树可以看出紫鸭跖草SpbHsf蛋白与水稻OsbHsf蛋白的亲缘距离最近，说明紫鸭跖草与水稻的Hsf基因的亲缘性最高，这与NCBI上的功能注释结果一致。进化树中SpbHsf基因家族缺失A7、A8、A9和B3亚类，部分亚类缺失可能是由于转录组测序拼接的紫鸭跖草基因序列不包含所有基因组信息所导致。

图 4 5种物种Hsf基因的系统进化树Fig. 4 Phylogenetic trees of Hsf genes from 5 species.

2.6 SpbHsf基因在不同铜浓度胁迫下紫鸭跖草根组织的表达模式

紫鸭跖草根组织中的SpbHsf基因在营养液组(0.25 µmol/L Cu2+)、胁迫组(100 µmol/L、300 µmol/L、1 000 µmol/L Cu2+) 表达模式如图 5所示，不同SpbHsf基因在不同Cu2+溶液中的表达模式可分为3类，第一类：有8个SpbHsf基因在Cu2+胁迫下的表达量显著上调，其中5个表达量显著上调的SpbHsf基因(SpbHsfA4c、SpbHsfB2b、SpbHsfC1a、SpbHsfC1b、SpbHsfB2b)在100 µmol/L Cu2+溶液中的表达量最高，3个表达量显著上调的SpbHsf基因(SpbHsfA1b、SpbHsfA3、SpbHsfA4b) 在300 µmol/L Cu2+溶液中的表达量最高，说明这8个SpbHsf基因在不同Cu2+溶液中始终参与胁迫应答反应，不同SpbHsf基因在不同Cu2+溶液中的应答反应程度有所不同；第二类：有4个A类基因(SpbHsfA1a、SpbHsfA1d、SpbHsfA4a、SpbHsfA5)、2个B类基因(SpbHsfB1a、SpbHsfB4b) 和2个C类基因(SpbHsfC2a、SpbHsfC2b) 在Cu2+胁迫下的表达量显著下调，说明紫鸭跖草的根组织中，Cu2+的胁迫在一定程度上会抑制这8个SpbHsf基因的表达；第三类：有4个SpbHsf基因的表达量随着Cu2+浓度增加先显著上调后显著下调，其中SpbHsfA2b、SpbHsfB1a、SpbHsfB2a基因在100 µmol/L Cu2+溶液中表达量最高，SpbHsfB1b基因在300 µmol/L Cu2+溶液中表达量最高，说明这4个SpbHsf基因在低浓度Cu2+胁迫中参与应答反应，在高浓度Cu2+胁迫中的表达受到抑制从而不参与应答反应。通过铜胁迫下的表达模式分析，我们发现紫鸭跖草中的SpbHsfA4b、SpbHsfB2b基因的显著上调表达与镉胁迫下东南景天的SaHsfA4、SaHsfB2的表达结果一致[13]，这一结果表明植物的SpbHsfA4亚类和SpbHsfB2亚类可能在参与调节重金属胁迫反应过程中具有重要的作用。

图 5 根组织中的SpbHsf基因家族成员在不同铜浓度胁迫下的表达模式分析Fig. 5 Expression pattern of SpbHsf genes in root tissue under different copper concentrations. Different lowercase letters indicate significant difference (P < 0.05).

3 讨论

植物的生长发育和生产受到许多外界生物和非生物胁迫的干扰，如热、冷、潮和重金属污染等[16]。在应对外界的各种胁迫中，植物都具有自己独特的防御系统或应对机制，在此过程中会涉及不同类型的转录因子。除了Hsf，还有WRKY、MYB、AP2/ERF、NAC等，它们在不同的应激条件下调控数千个基因的表达来抵御外界刺激[17-19]。在植物中，Hsf基因家族是植物中最重要的转录因子家族之一，其不仅受高温诱导，而且在抵抗非生物胁迫时也起到一定的作用[20]。研究植物对热、冷、潮和重金属等条件下的分子机制是提高植物抗逆性和生产力的前提，其基因产物起着为植物提供抗逆性的作用[21]。植物Hsf基因是调节各种应激反应基因表达的重要转录因子，在提供对多种非生物胁迫的耐受性方面起着关键作用[22]。

本研究通过挖掘紫鸭跖草全长转录组数据库数据，筛选鉴定出20个SpbHsf基因。并对SpbHsf基因的理化性质与结构、系统进化树、保守基序、结构域及在不同Cu2+浓度胁迫下表达模式进行分析。保守基序分析表明，各亚类的SpbHsf基因均含有一类或几类相同的保守基序，表明SpbHsf基因在进化中过程中相对比较保守。结构域分析表明，SpbHsf蛋白含有3个α-螺旋和4个β-折叠的特征的DBD结构域，表明鉴定出的20个SpbHsf基因具有Hsf基因的结构特征。在与5个物种的系统进化树构建中，不同物种间的各个亚类进化保守、层次分明，表明SpbHsf基因与水稻的OsHsf基因的同源性最高。

Hsf基因会通过调节活性氧(reactive oxygen species, ROS) 的浓度和调控下游基因/蛋白的表达来增强非生物胁迫的耐受性。例如，HsfA1a基因可通过调节咖啡酸-O-甲基转移酶(COMT) 基因的转录和诱导褪黑激素的积累来增强番茄的镉耐受性，褪黑素可与ROS发生氧化还原反应，从而维持胁迫条件下植物体内的氧化还原平衡。番茄的HsfA1a基因沉默会降低褪黑激素的含量，同时番茄的镉耐受性也随之减低；HsfA1a基因的过表达能刺激COMT基因的表达及褪黑激素的积累，并增强番茄的镉耐受性[23-24]。陈双双[13]发现东南景天SaHsfA4ah和SaHsfA4ch基因参与调控Cd胁迫应答，野生型拟南芥受到镉胁迫后，其叶片会发黄甚至枯萎，但过表达SaHsfA4ah或SaHsfA4ch基因的拟南芥生长状况较好，镉吸收速率高于野生型，且能通过调控下游AtNramp6基因和AtHsps蛋白的表达水平来增强拟南芥的耐镉性。已有研究表明，DBD结构域是Hsf蛋白参与胁迫应答的关键结构，Chen等发现含有DBD结构域的SaHsfA4c蛋白具有镉抗性，而包含不完整DBD结构域的InSaHsfA4c蛋白不具有镉抗性[25]。我们发现除了SpbHsf4a蛋白，其他SpbHsf蛋白都含有motif 2，这可能是由于SpbHsf4a蛋白的DBD结构域缺失β3折叠所导致，且从SpbHsf4a基因的表达模式中可以发现，SpbHsf4a基因在铜胁迫下的表达量始终显著下调，说明不含完整DBD结构域的SpbHsf4a蛋白不具有抗铜性。Hsf基因是一类研究相对比较深入的基因家族，目前对植物Hsf基因的功能在重金属的研究多集中于镉胁迫，目前关于Hsf基因在铜胁迫响应的相关研究不够深入，例如桑建[26]发现东南景天的3个SaHsf基因在铜胁迫下的表达显著上调，董雪芳[27]发现菠菜的SoHsf基因在酵母中异源表达能提高酵母对铜的耐受性，但他们均未对Hsf基因的耐铜机制进行进一步研究及分析。基因的表达模式与它们所行使的功能息息相关，分析表达模式有利于找出潜在的迫应答基因。本文通过分析不同铜浓度胁迫下紫鸭跖草根组织的20个SpbHsf基因的表达模式，并从中鉴定出8个未报道过的潜在铜胁迫应答基因，为后续研究紫鸭跖草耐铜性机制及Hsf基因在铜胁迫的应答机制提供了一定的理论依据。

4 结论

本研究共筛选鉴定出20个SpbHsf基因家族成员，预测分析表明，SpbHsf基因作用于5个细胞结构中，SpbHsf蛋白均含有DBD及HR-A/B保守结构域。20个SpbHsf基因在不同Cu2+浓度中表达模式不同，发现8个SpbHsf基因会受不同铜浓度胁迫诱导显著上调表达，其中SpbHsfA4b和SpbHsfB2b基因的表达模式与镉胁迫下东南景天SaHsf基因的表达模式相似，表明SpbHsf基因在防御Cu2+毒害上起一定作用。本研究为研究紫鸭跖草的耐铜性机制和Hsf基因应对Cu2+胁迫的分子机制提供了初步依据。

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