一种多肉植物的遗传转化方法和应用与流程

本发明属于植物遗传转化技术领域。更具体地，涉及一种多肉植物的遗传转化方法和应用。

背景技术：

从上世纪八十年代第一个转基因植物诞生开始，基因工程技术被用在了越来越多的植物中。科学家们正在用这项革命性的新技术解决着各种植物种植生产中遇到的问题，比如植物的抗逆、抗虫、产量低下等问题。而当前情况下对于园艺植物中的多肉植物来说，最需要解决的就是新品种产生缓慢的问题。经过欧洲园艺科学家近百年的多肉植物杂交育种，市场上绝大多数多肉植物已不具有杂交育种潜能，而分子育种技术在此领域的应用又不成熟，新品种出现速度很慢。而新品种的多肉植物经济效益相对较高，花农大都喜欢种植新品种，再加上多肉植物可快速进行无性繁殖，在育种缓慢的背景下少数的新品种常在市场中快速饱和，最终往往达不到花农预期的收益。

目前，美国冷泉港实验室公开了景天科伽兰菜属落地生根的遗传转化方法，包括：植物预处理、农杆菌制备、植物组织和农杆菌的共培养、阳性植物筛选和生根炼苗培养等过程(helenagarcêsetal，transformationoftheplantdaigremontianausingagrobacteriumtumefaciens，2015)。但是，该方法存在以下缺点：(1)泛用性不强：该方法的研究对象是落地生根，其属于大型多肉植物，现有技术已对其习性研究透彻，且其叶片较大、叶表皮坚固，能够耐受高浓度(10％)次氯酸的洗涤；而由于不同多肉植物脱分化和再分化所需求的激素浓度、生长条件大相径庭，对于大多数多肉植物来说，并没有适合它们生长的培养基激素浓度的研究报道，且在10％次氯酸条件下大多数多肉植物会受到巨大伤害，同时影响芽的再生，降低转化效率；因此，该方法对大多数多肉植物都不适用。(2)筛选时间较长，操作繁琐：多肉植物叶片转化的阳性筛选不同于其他植物，多肉植物叶片较厚，叶片远离培养基的一侧对农杆菌抑制效果较差，此处更容易导致农杆菌污染；而该方法中出芽筛选过程长达2～3个月，且不到两周需更换一次培养基，使得整个出芽筛选过程要至少进行4～6次培养基更换，整个转基因过程将至少更换培养基6～8次，耗时长、操作繁琐。

因此，亟需提供一种适用范围广、操作简便、效率高、短时间内即能实现多肉植物遗传转化的方法。

技术实现要素：

本发明要解决的技术问题是克服现有多肉植物遗传转化方法的上述缺陷和不足，提供一种多肉植物的遗传转化方法和应用。本发明首次运用了无菌叶法转化多肉植物的理念，利用了多肉植物叶片再生能力强大、易行成不定芽的特点，得到了无需经过常规转化过程中脱分化、再分化阶段，直接转化新生的不定芽的方法；该方法得到的多肉植物的出芽数更多、出芽时间更短，并且适用于易于出不定芽的多肉植物。

本发明的目的是提供一种多肉植物的遗传转化方法。

本发明另一目的是提供所述方法在多肉植物遗传转化中的应用。

本发明上述目的通过以下技术方案实现：

本发明提供了一种多肉植物的遗传转化方法，将多肉植物外植体消毒、不定芽诱导培养得到无菌苗后，与已转入带有抗性基因的重组载体的农杆菌共培养，筛选阳性植物，炼苗。

具体优选地，所述方法包括以下步骤：

s1.将多肉植物用70％乙醇冲洗25～35秒，再用2％次氯酸溶液浸泡4～10分钟，无菌水冲洗4～6次，切割后放入通用出芽培养基中进行光照培养，得到多肉植物无菌苗；

s2.将带有抗性基因的重组载体转入农杆菌后，与步骤s1得到的多肉植物无菌苗共培养；

s3.将步骤s2共培养后的多肉植物放入生芽筛选培养基中进行培养，炼苗，将所得幼苗放在多肉植物培养土中生长，即得遗传转化后的多肉植物。

步骤s1所述的浸泡时间可以根据多肉植物叶片表面的平整度而定，表面越光滑，则浸泡时间越短。

优选地，步骤s1所述次氯酸溶液的浓度为2％～3％。

优选地，步骤s1所述光照培养的光照强度为1500～2500lux。

更优选地，步骤s1所述光照培养的光照强度为2000lux。

优选地，步骤s1所述光照培养的时间为12～16小时/天。

更优选地，步骤s1所述光照培养的时间为14小时/天。

本发明方法中应用了通用出芽培养基和生芽筛选培养基，适用于大规模转化种类范围更广的多肉植物。

优选地，步骤s1所述通用出芽培养基为：在ms培养基中加入6-苄基腺嘌呤、萘乙酸、蔗糖和琼脂。

优选地，所述通用出芽培养基中萘乙酸的浓度为0.1～0.3mg/l。在此激素(萘乙酸)浓度下的通用出芽培养基中，大多数多肉植物均能够形成无菌苗。

更优选地，所述通用出芽培养基中萘乙酸的浓度为0.1mg/l。

优选地，所述通用出芽培养基中6-苄基腺嘌呤的浓度为0.1～1.0mg/l。

更优选地，所述通用出芽培养基中6-苄基腺嘌呤的浓度为0.5mg/l。

优选地，所述通用出芽培养基中琼脂的浓度为6％～8％。

更优选地，所述通用出芽培养基中琼脂的浓度为6％。

具体优选地，步骤s1所述通用出芽培养基的配方为：ms培养基、外加0.5mg6-苄基腺嘌呤、0.1mg萘乙酸、30g蔗糖、6.0g琼脂、ph5.8。

优选地，步骤s3所述生芽筛选培养基的配方为：在ms培养基中加入6-苄基腺嘌呤、萘乙酸、蔗糖、琼脂、卡那霉素和噻孢霉素。

优选地，所述生芽筛选培养基中萘乙酸的浓度为0.05～0.1mg/l。在此激素浓度下的生芽筛选培养基中，大多数多肉植物被转化的叶片均能够形成新的不定芽，并且避免形成愈伤组织。

更优选地，所述生芽筛选培养基中萘乙酸的浓度为0.05mg/l。

优选地，所述生芽筛选培养基中6-苄基腺嘌呤的浓度为0.1～1.0mg/l。

更优选地，所述生芽筛选培养基中6-苄基腺嘌呤的浓度为0.5mg/l。

优选地，所述生芽筛选培养基中琼脂的浓度为6％～8％。

更优选地，所述生芽筛选培养基中琼脂的浓度为6％。

优选地，所述生芽筛选培养基中卡那霉素的浓度为25～50μm。

更优选地，所述生芽筛选培养基中卡那霉素的浓度为40μm。

优选地，所述生芽筛选培养基中噻孢霉素的浓度为300～400μm。

更优选地，所述生芽筛选培养基中噻孢霉素的浓度为300μm。

具体优选地，步骤s3所述生芽筛选培养基的配方为：ms培养基、外加0.5mg6-苄基腺嘌呤、0.05mg萘乙酸、30g蔗糖、6.0g琼脂、40μm卡那霉素、300μm噻孢霉素、ph5.8。

优选地，步骤s2所述共培养的温度为23℃～28℃。

优选地，所述炼苗的时间为7～14天。

本发明对农杆菌、载体没有特别要求，基因工程常用的农杆菌、载体都能够应用在本发明中。

具体优选地，所述农杆菌为eha105根癌农杆菌。

具体优选地，所述载体为pcambia1300载体。

具体优选地，植物筛选抗性为nptii。

另外，所述方法在多肉植物遗传转化中的应用，也应在本发明的保护范围之内。

优选地，所述多肉植物为景天科拟石莲属、风车草属、景天属或伽兰菜属的多肉植物。

更优选地，所述多肉植物为虹之玉、紫乐、黄丽、红宝石或姬秋丽中的任意一种或几种。

本发明具有以下有益效果：

本发明提供了一种泛用性强的多肉植物遗传转化方法，该方法能够广泛应用于大多数多肉植物的遗传转化，适用于大规模转化不同品种的多肉植物(如景天科拟石莲属、风车草属、景天属、伽兰菜属等)，使得种类繁多且生长需求各异的多肉植物的转基因育种成为了可能，并且极大的缩短了阳性筛选的时间，减少了人工操作，增大了阳性转化的数量。

本发明利用了多肉植物叶片基部强大的再生、出芽能力(与传统植物相比，多肉植物的生殖方式主要为无性生殖，叶片脱落后，叶柄处和叶痕处均有形成不定芽的能力)，进行转化的植物组织为多肉植物的无菌叶片，创造了新的遗传转化模式-无菌叶法，解决了不同多肉植物对激素浓度要求差异过大的问题，甚至能够实现多种多肉植物同时转化，且转化结果相互独立，用最少的操作得到最大化的多肉植物新品种，大大提升了转化的速度和效率，节省了人工操作，使得其操作更加易行。

另外，该方法降低了多肉植物的遗传转化成本，尤其是在多品种、多种基因转化过程中成本降低非常显著，且长期来看，该方法的育种速度明显优于传统转基因方法；因此，该方法在多肉植物的遗传转化中具有很好的应用前景。

附图说明

图1是本发明制备得到的虹之玉无菌苗和紫乐无菌苗培养3个月的形态图；其中，左图为虹之玉无菌苗；右图为紫乐无菌苗。

图2是本发明pcambia1300-nptii重组载体的骨架示意图。

图3是本发明筛选后得到的虹之玉阳性幼苗和紫乐阳性幼苗的形态图；其中，1为虹之玉，2为紫乐。

图4是核酸检测验证结果图；其中，m：marker；1：空白对照；2～4：虹之玉匀浆；5～6：紫乐匀浆。

具体实施方式

以下结合具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。

除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。

实施例1多肉植物虹之玉的遗传转化

1、实验方法

一种多肉植物虹之玉的遗传转化方法，包括以下步骤：

1)无菌苗的制备

(1)外植体的消毒

选择健康的多肉植物虹之玉(sedumxrubrotinctumclausen)，掰取干净没有疤痕的叶片，用水冲洗后放入超净工作台，用70％乙醇冲洗30秒，再用2％次氯酸溶液浸泡5分钟进行消毒，无菌水冲洗5次后，用吸水纸吸干叶片表面的水分；根据以下外植体的切割标准对叶片进行切割，备用；

外植体的切割标准：疤痕(点状或者物理损伤)、干枯的部分全部切除；消毒时间4～6分钟的无需切割；消毒时间为6～8分钟的切除叶柄损伤部位；消毒时间8～10分钟的切开叶片，去除部分中央储水组织，将植物切成薄片，叶片相对较薄的则直接切成片。

(2)不定芽的诱导培养

将以上消毒、切割后的虹之玉叶片放入通用出芽培养基(ms培养基、外加0.5mg6-苄基腺嘌呤、0.1mg萘乙酸、30g蔗糖、6.0g琼脂、ph5.8)，置于25℃恒温培养室，光照强度为2000lux，光照时间为14小时/天；

消毒时间＜6分钟的多肉植物(虹之玉)2周即可产生单芽、丛生芽、或者分裂活性很强的细胞团，2～3个月即可长满组培瓶，得到多肉植物无菌苗，用于下一步实验，在此状态可以继续保存2～3个月。

消毒时间＞8分钟的多肉植物出芽缓慢或出芽较少，可以将少数出芽的多肉植物单独移入新的通用出芽培养基，直到其长满培养瓶或者具有多数叶片年龄超过1个月的叶片即可。

2)农杆菌和载体的制备

(1)应用的菌株为eha105根癌农杆菌，pcambia1300载体作为骨架，将抗性基因(nptii)构建到pcambia1300-nptii重组载体上，再把重组载体电转化入eha105根癌农杆菌中，涂到固体lb培养基上，加入适量卡那霉素和氯霉素28℃培养2天，直到出现明显的单菌落。

(2)挑取单菌落到液体lb培养基中，加入10μm卡那霉素和25μm氯霉素培养1-2天至菌液生长到达平台期，此时od600＞1.5。

(3)取上述菌液1ml重新加入10ml含10μm卡那霉素和25μm氯霉素的液体lb培养基(菌液与液体lb培养基的体积比为1：10)，28℃、200转/分钟培养2.5小时(od600为0.5)，6000转/秒离心10分钟，去上清，收集菌体。

3)农杆菌与多肉植物的共培养

(1)将以上得到的菌体重悬于共培养液(ms培养基、外加15μm乙酰丁香酮)使od600为0.5，室温下静置2小时。

(2)将无菌虹之玉从组培瓶取出，用镊子掰下较大的叶片，浸没于共培养液，25℃静置浸染2.5小时。

(3)去除共培养液，用吸水纸吸干叶片表面的水分，放到无菌的空瓶中晾干，黑暗下放置2天。

4)阳性植物筛选

(1)将经过以上处理得到的虹之玉放入生芽筛选培养基(ms培养基、外加0.5mg6-苄基腺嘌呤、0.05mg萘乙酸、30g蔗糖、6.0g琼脂、40μm卡那霉素、300μm噻孢霉素、ph5.8)，培养温度为25℃恒温培养，光照强度为2000lux，光照时间为12小时/天；

2周即可见明显的芽，如果期间农杆菌过度生长则转移入新的生芽筛选培养基；此时芽点较多、较小，但已经可以移栽成活，如果想得到芽点较为密集的虹之玉，则再继续培养1～2周进一步筛选。

5)炼苗

(1)将以上得到的虹之玉幼苗连同转化的叶片一起取出，用清水冲洗，洗净后放在卫生纸上晾干，置于与阳性植物筛选时相同的光源(光照强度为2000lux)下7天，叶面干燥(出现褶皱)时需撒少量的水，直到在空气中长出幼根。

(2)将幼苗轻轻放在多肉植物培养土(幼苗期间可以泥炭土偏多，泥炭土：蛭石：珍珠岩为6：1：1)表面，放置于散光下，在大棚中需要做遮光处理。

(3)待幼苗完全适应自然环境后(以长出两对新叶片为准)，将其放入虹之玉最适生长环境，即完成了虹之玉的遗传转化过程。

然后，进行核酸检测验证，具体步骤为：从得到的健康虹之玉植株上用刀削下一点叶片，在2.0ml离心管中捣成浆糊状，加1ml蒸馏水，摇匀得虹之玉匀浆；取1μm匀浆作为模板，并设置空白对照，用南京诺唯赞公司的greentaqmix产品进行pcr检测，pcr操作流程按产品操作说明书，检测引物序列为：正向引物：5’-tgattgaacaagatggattg-3’；反向引物：5’-aaggtgagatgacaggagat-3’；将pcr产物用琼脂糖凝胶电泳检测。

2、实验结果

本发明制备得到的虹之玉无菌苗培养3个月的形态如图1中的左图所示，可以看出，此时虹之玉生长旺盛，适合进行遗传转化。本发明pcambia1300-nptii重组载体的骨架示意图如图2所示。

本发明筛选后得到的虹之玉阳性幼苗的形态如图3所示，可以看出，经过筛选后的虹之玉阳性幼苗具有卡那霉素抗性。

核酸检测验证结果如图4所示，可以看出，阳性片段大小为300bp，扩增片段位于nptii基因内部，说明nptii基因已转化入植物体内，虹之玉的遗传转化成功。

实施例2多肉植物紫乐的遗传转化

1、实验方法

一种多肉植物紫乐的遗传转化方法，与实施例1相同。

2、实验结果

本发明制备得到的紫乐无菌苗培养3个月的形态如图1中的右图所示，可以看出，此时紫乐生长旺盛，可以进行遗传转化。

本发明筛选后得到的紫乐阳性幼苗的形态如图3所示，可以看出，经过筛选后的紫乐阳性幼苗具有卡那霉素抗性。

核酸检测验证结果如图4所示，可以看出，阳性片段大小为300bp，扩增片段位于nptii基因内部，说明紫乐的遗传转化成功。

对比例1

不制备无菌苗，虹之玉叶片直接与农杆菌共培养，具体方法为：从虹之玉健康植株掰取叶片，用70％酒精冲洗30秒，再用2％次氯酸浸泡5分钟，用清水洗涤5遍，以此作为遗传转化的材料；其余具体的转化方法与实施例1相同。

结果：能够产生筛选阳性植株，但消毒过程中叶柄处具有生成不定芽能力的细胞受损，最终转化效率为实施例1的无菌叶法的10％左右。

对比例2

通用出芽培养基配方改变，具体配方为：ms培养基、外加5mg6-苄基腺嘌呤、1mg萘乙酸、30g蔗糖、6.0g琼脂、ph5.8；其余具体的转化方法与实施例1相同。

结果：当6-苄基腺嘌呤超过1mg(为5mg)时，易产生大量愈伤组织，但不易分化产生芽，或者丛芽密集导致无菌苗叶片较小；当萘乙酸超过0.3mg(为1mg)时，外植体难以出芽或者产生大量根，难以达到实验所需无菌苗的标准。

对比例3

生芽筛选培养基配方改变，具体配方为：ms培养基、外加6mg6-苄基腺嘌呤、3mg萘乙酸、30g蔗糖、6.0琼脂、25～50μm卡那霉素、300-400μm噻孢霉素、ph5.8；其余具体的转化方法与实施例1相同。

结果：当6-苄基腺嘌呤超过1mg(为6mg)时，易产生愈伤组织，出芽时间变长；当萘乙酸超过0.1mg(为3mg)时，出芽很少，不足以完成遗传转化。

对比例4

生芽筛选培养基配方改变，具体配方为：ms培养基、外加0.5mg6-苄基腺嘌呤、0.05mg萘乙酸、30g蔗糖、6.0g琼脂、40μm卡那霉素、150μm噻孢霉素、ph5.8；其余具体的转化方法与实施例1相同。

结果：当噻孢霉素低于300μm(为150μm)时，农杆菌难以抑制，通常一周内即可污染。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

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