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含芦荟提取物的组合物及其应用.pdf

来源：花匠小妙招时间：2024-12-20 08:22

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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 202010693083.2 (22)申请日 2020.07.17 (71)申请人澳门科技大学地址中国澳门氹仔伟龙马路澳门科技大学 (72)发明人张伟姜志宏李妍杨紫薇郭建茹王彩云 (74)专利代理机构广州嘉权专利商标事务所有限公司 44205 代理人尹凡华 (51)Int.Cl. A61K 36/896(2006.01) A61K 36/886(2006.01) A61P 35/00(2006.01) A61K 31/4745(2006.01) (54)发明名称。

2、一种含芦荟提取物的组合物及其应用 (57)摘要本发明属于医药领域，公开了一种含芦荟提取物的组合物及其应用，所述组合物包括芦荟提取物和喜树碱及其衍生物，芦荟提取物和喜树碱及其衍生物联合使用能够增加对癌细胞中DNA损伤，上调H2AX蛋白水平，阻滞细胞周期于S期，诱导细胞凋亡和抑制WNT/catenin信号通路，两者协同增效，增强癌细胞的细胞毒活性，以达到抗癌的作用。可以将其应用在抗癌药物、 WNT/ catenin通路抑制剂、 WNT/catenin通路信号素失活剂的制备中。权利要求书1页说明书9页附图7页 CN 111773301 A 2020.10.16。

3、 CN 111773301 A 1.一种含芦荟提取物的组合物，其特征在于，包括芦荟提取物和喜树碱及其衍生物。 2.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述组合物包括芦荟提取物和喜树碱衍生物；所述喜树碱衍生物为10-羟基喜树碱。 3.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述芦荟提取物的含量为50-400ug/ml，所述喜树碱及其衍生物的含量为2.5-50uM。 4.根据权利要求3所述的组合物，其特征在于，所述芦荟提取物的含量为50-150ug/ml，所述喜树碱及其衍生物的含量为5-30uM。 5.根据权利要求1-4中任一项所述的组合物，其特征在于，所述芦荟提取。

4、物采用水或/ 和醇浸提得到。 6.一种药物，其特征在于，包括权利要求1-5中任一项所述的组合物和辅料。 7.权利要求1-5中任一项所述的组合物在制备抗癌的药物中的应用。 8.权利要求1-5中任一项所述的组合物在制备抗肝癌的药物中的应用。 9.权利要求1-5中任一项所述的组合物在制备WNT/ -catenin通路抑制剂中的应用。 10.权利要求1-5中任一项所述的组合物在制备WNT/ -catenin通路信号素失活剂中的应用。权利要求书 1/1 页 2 CN 111773301 A 2 一种含芦荟提取物的组合物及其应用技术领域 0001 本发明属于医药领域，具体涉及一种含芦荟提取物的。

5、组合物及其应用。背景技术 0002 癌症是严重威胁我国乃至全世界人民生命的常见疾病，位居死亡原因第一。近年来，尽管肿瘤早期诊断、早期发现技术有了很大进步，标准的化疗和放疗已在临床上应用了几十年，但大多数临床中晚期患者的整体生存率仍无明显改善。正常细胞演变为癌细胞，就会具备癌症细胞的6个基本特征：维持增殖的信号，避免增殖抑制，抵抗细胞死亡，诱导血管生成，无限制的复制，激活侵袭和转移。整个癌变过程可以分为癌症发生阶段、癌症进展阶段和癌症转移阶段。被诊断出的癌症患者大部分已是中期或晚期，癌细胞的大量存在、复制、转移，威胁着患者的生命，但目前仍。

6、然没有很好的药物能够有针对性的杀死癌细胞，但对正常细胞损伤较小。 0003 WNT/ -catenin信号通路参与多种发育过程以及许多癌症的发生和发展，特别是结直肠癌和肝癌。经典WNT信号通路中的关键调控步骤包括 -catenin的磷酸化，泛素化和随后的降解过程。该过程涉及一个专门的细胞质破坏复合物，该复合物由支架蛋白Axin和瘤性息肉病(APC)、糖原合成酶激酶-3 / (GSK-3)、酪蛋白激酶1(CKI)这三个核心成分组成。一旦WNT配体与受体复合物结合形成一种七跨膜结构域的fryzzle蛋白或LDL受体相关蛋白家族的单程跨膜蛋白(特别是LRP5或LRP6)。

7、，信息转导后会抑制Axin介导的 -catenin 磷酸化，而使未磷酸化的 -catenin积聚并传送至细胞核，从而与TCF/LEF(T细胞因子/淋巴增强因子)家族的DNA结合蛋白形成复合物并激活WNT靶基因表达。而目前针对WNT/ - catenin信号通路的药物少，且未体现出卓越的效果。 0004 因此，亟需提供有一种抑制癌细胞中的WNT/ -catenin通路的组合物。发明内容 0005 本发明旨在至少解决上述现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提出一种含芦荟提取物的组合物，能够抑制癌细胞中的WNT/ -catenin通路。 0006 一种含芦荟提取物的组合。

8、物，包括芦荟提取物和喜树碱及其衍生物。 0007 优选的，所述组合物，包括芦荟提取物和喜树碱衍生物；进一步优选的，所述喜树碱衍生物为10-羟基喜树碱(HPT)。 0008 优选的，在所述组合物中，所述芦荟提取物的含量为50-400ug/ml，所述喜树碱及其衍生物的含量为2.5-50uM；进一步优选的，所述芦荟提取物的含量为50-150ug/ml，所述喜树碱及其衍生物的含量为5-30uM。 0009 优选的，所述含芦荟提取物的组合物，所述芦荟提取物采用水或/和醇浸提得到；进一步优选的，所述芦荟提取物采用水浸提得到。 0010 一种药物，包括所述的含芦荟提取物。

9、的组合物和辅料。 0011 所述药物为要学上可接受的任意剂型，如片剂、粉剂或胶囊剂。说明书 1/9 页 3 CN 111773301 A 3 0012 所述含芦荟提取物的组合物在制备抗癌的药物中的应用；优选的，所述含芦荟提取物的组合物在制备抗肝癌的药物中的应用。 0013 所述组合物在制备WNT/ -catenin通路抑制剂中的应用。 0014 所述组合物在制备WNT/ -catenin通路信号素失活剂中的应用。 0015 相对于现有技术，本发明的有益效果如下： 0016 本发明中所述含芦荟提取物的组合物，包括芦荟提取物和喜树碱及其衍生物，芦荟提取物和喜树碱及其衍生物联合使。

10、用能够增加对癌细胞中DNA损伤，上调H2AX蛋白水平，阻滞细胞周期于S期，诱导细胞凋亡和抑制WNT/ -catenin信号通路，两者协同增效，增强癌细胞的细胞毒活性，以达到抗癌的作用。附图说明 0017 图1为实施例1、实施例2中细胞毒性MTT试验结果图； 0018 图2为实施例1、实施例2中HepG2细胞彗星分析结果图； 0019 图3为实施例1、实施例2中HepG2细胞周期分析图； 0020 图4为实施例1、实施例2中HepG2细胞凋亡分析图； 0021 图5为实施例1、实施例2中HepG2细胞中的WNT/ -catenin通路的蛋白水平图； 0022 其中，。

11、*P0.05， *P0.01，与对照组相比； P0.05， #P0.01，与HPT组相比。具体实施方式 0023 为了让本领域技术人员更加清楚明白本发明所述技术方案，现列举以下实施例进行说明。需要指出的是，以下实施例对本发明要求的保护范围不构成限制作用。 0024 以下实施例中所用芦荟提取物购买于一方制药有限公司(中国广州)。其他的原料、试剂或装置如无特殊说明，均可从常规商业途径得到，或者可以通过现有已知方法得到。 0025 实施例1 0026 称量芦荟提取物，在过滤提取物之前，将芦荟提取物在80的水中超声提取30分钟。芦荟提取液使用前储被存在-20备用。取。

12、HPT，与芦荟提取物混合制备成组合物1，其中 HPT的浓度为10uM，芦荟提取物的含量为50ug/ml。 0027 实施例2 0028 称量芦荟提取物，在过滤提取物之前，将芦荟提取物在80的水中超声提取30分钟。芦荟提取液使用前储被存在-20备用。取HPT，与芦荟提取物混合制备成组合物2，其中 HPT的浓度为10uM，芦荟提取物的含量为100ug/ml。 0029 产品效果测试 0030 将实施例1和实施例2制得的组合物进行如下试验。 0031 材料和方法 0032 1.药品和试剂 0033 人肝细胞癌HepG2细胞由美国菌种保藏中心(ATCC)(美国马里兰州罗克维尔/ 。

13、Rockville,MD,USA)提供； 0034 DMEM培养基、青链霉素溶液、胎牛血清(FBS)和0.25胰酶EDTA溶液均购自GIBCO 说明书 2/9 页 4 CN 111773301 A 4 Invitrogen公司(美国加利福尼亚州卡尔斯巴德/Carlsbad,CA,USA)； 0035 10-羟基喜树碱(HPT)购自成都曼思特生物科技有限公司(中国成都)； 0036 超纯水自Milli-Q纯水系统(美国马萨诸塞州贝德福德/Bedford ,MA ,USA， Millipore公司)获得； 0037 质谱级甲醇，乙腈和乙酸购自Anaqua Chemical Supply公司(。

14、美国得克萨斯州休斯顿/Houston,TX,USA)； 0038 稳定同位素标记的13C1015N5-三磷酸腺苷(ATP13C15N)、二甲基亚砜(DMSO)，胰酶-EDTA溶液和3-(4 ,5)-二甲基-2噻唑-2,5-二苯基溴化四氮唑(MTT)购自Sigma Aldrich Chemical公司(美国密西根州圣路易斯/St.Louis,MO,USA)； 0039 30氢氧化铵水溶液(NH4OH)，乙酸铵(NH4OAc)购自Sigma-Aldrich公司(美国密西根州圣路易斯/St.Louis,MO,USA)。 0040 HPLC质量级甲醇、乙腈和乙酸(AcOH)购自JT Ba。

15、ker Chemical公司(美国新泽西州菲利普斯堡/Phillipsburg,NJ,USA)； 0041 甲酸购自Fisher Scientific公司(美国新泽西州费尔劳恩/Fair Lawn,NJ,USA)；乙醚购自Tedia公司(美国俄亥俄州费尔菲尔德/Fairfield,OH,USA)； 0042 四氟硼酸(HBF4)和三甲基甲硅烷基重氮甲烷(TMSD；在己烷中为2M)由Alfa Aesar 公司提供(美国马萨诸塞州沃德希尔/Ward Hill， MA， USA)； 0043 色谱柱Sepax GP-C18(2.1150mm， 1.8 m)从Sepax Technologies。

16、获得(美国特拉华州纽瓦克/Newark， DE， USA)。 0044 2.植物原材料 0045 本申请中的库拉索芦荟/Aloe barbadensis miller为干燥的芦荟渗出液，购买于一方制药有限公司(中国广州)。 0046 3.芦荟提取物的LC-MS/MS分析 0047 芦荟素A(98)、芦荟素B(98)、芦荟宁(98)和芦荟苦素(98)的标准物购自宝鸡市辰光生物有限公司(中国宝鸡)；超纯水自Milli-Q纯水系统(美国马萨诸塞州贝德福德/Bedford,MA,USA,Millipore公司)获得；质谱级乙腈购自Anaqua Chemical Supply公司(美国。

17、得克萨斯州休斯顿/Houston,TX,USA)。 0048 芦荟提取物在Thermo Fisher TSQ LC-MS/MS系统上进行，该系统由Accela自动进样器， Accele泵和Quantum Access三重四极杆质谱仪组成(Thermo Fisher Scientific公司，美国加利福尼亚州圣何塞/San Jose,CA,USA)。使用Sepax GP-C18色谱柱(2.1mm 150mm， 1.8 m， Thermo Fisher Scientific公司,美国加利福尼亚州圣何塞/San Jose,CA, USA)进行色谱分离。洗脱液为30的乙腈水，液体流速设定。

18、为0.3mL/min，柱温保持在35，在350的温度和15psi的辅助气压下，将负离子模式下的离子喷雾电压设置为3000V。如表 1所示，使用质谱多反应监测(MRM)技术进行定量分析。 0049 表1.质谱多反应监测(MRM)的设置 0050 说明书 3/9 页 5 CN 111773301 A 5 0051 0052 4.细胞培养 0053 在添加了10胎牛血清(FBS)， 100单位/mL青霉素， 100 g/mL链霉素的DMEM培养基中培养HepG2细胞，将其置于37、 5CO2条件下的培养箱中孵育。将HepG2细胞接种于 100mm20mm的培养皿中(Corning I。

19、nc，美国纽约州康宁/Corning,NY,USA)。过夜培养后，将细胞分为以下几组：对照组(C)，将细胞与单独的培养基一起孵育48小时； 10-羟基喜树碱组(HPT)，首先将细胞与培养基一起孵育24小时，然后将其暴露于10.0 M的HPT中培养24小时；芦荟提取物组(Aloe)，将细胞暴露于50.0 g/mL或100.0 g/mL的芦荟提取物中48小时；组合组(包括组合物1和组合物2)，将细胞用组合物1和组合物2分别处理24小时。在细胞收获当天，将额外的细胞培养皿用于细胞计数，以使核苷酸库标准化，并通过台盼蓝拒染实验测定存活率。 0054 5.细胞毒性试。

20、验 0055 通过细胞毒性MTT实验测定确定不同组对HepG2细胞的抑制作用。将HepG2细胞以1 104细胞/孔的密度接种在96孔板中(LabServ,Thermo Fisher Scientific Co,中国北京)。孵育后，将它们用一定浓度的HPT，芦荟或组合物(包括组合物1和组合物2)处理24、 48和72小时。将MTT溶液(培养基中最终浓度为0.5mg/mL)加入到每个孔中，并进一步温育4 小时。移走培养基，向每个孔中加入100 L DMSO以溶解紫色结晶甲臜。使用微孔板UV/VIS分光光度计在570nm处测量吸光度(Infinite M200 PRO,Teca。

21、n Austria GmbH 5082,奥地利格勒迪希/Austria)，参考波长为650nm。使用血细胞计数器测定细胞数。通过 GraphPad Prism软件(GraphPad Software公司，美国加利福尼/CA,USA)计算IC 50值最大抑制浓度的一半(50)。细胞存活率()OD(处理)-OD(空白)/OD(对照，未处理)-OD (空白)100。药物相互作用通过组合指数(CI)方法进行评估，而CI1分别表示协同作用，累加作用或拮抗作用。 CI值通过CompuSyn软件计算(ComboSyn公司，美国纽约/NY,USA)。 0056 6.结晶紫染色试验。

22、0057 为了直观地观察药物对细胞的功效，通过结晶紫染色法评估细胞存活率。简而言之，用10.0 M HPT培养基、 50.0 g/mL芦荟培养基、 100.0 g/mL芦荟培养基或组合物培养基 (包括组合物1和组合物2)处理6孔板中的HepG2细胞(2.0105细胞/孔)。随后，将细胞用 0.5结晶紫染色。 PBS冲洗后，使用Quantity One软件克隆计数功能对菌落进行计数(Life Science Research&Clinical Diagnostics ,Bio-Rad Ltd，美国加利福尼亚州/ California,USA)。 0058 7.免疫荧光试验 005。

23、9 HepG2细胞生长在6孔板的玻璃圆形培养片上，加入HPT，芦荟及组合组(包括组合物1和组合物2)，分别孵育48小时。处理结束时，用PBS洗涤细胞并在室温下用4多聚甲醛固定细胞15分钟。随后，将细胞用PBS洗涤三次，并于室温下在5(w/v)BSA中孵育30分钟以说明书 4/9 页 6 CN 111773301 A 6 封闭细胞，然后与相应的一抗gamma H2A.X在4下孵育12小时(phospho S139)9F3 (ab26350),稀释比例1:100；英国剑桥/Cambridge,UK)。然后，在用PBS洗涤3次后，将细胞与合适的二抗山羊抗小鼠IgG H。

24、&594(稀释比例1:500，英国剑桥/Cambridge,UK)在5BSA中于室温下黑暗中孵育1小时。最后，使用1 g/mL的蓝色荧光 DAPI(4,6-二脒基-2-苯基吲哚； Sigma-Aldrich)对核DNA进行染色。使用荧光显微镜进行成像分析(Leica Microsystems公司，德国韦茨拉尔/Wetzlar,Germany)。 0060 8.HPT诱导的DNA损伤和彗星试验 0061 将HepG2细胞以4105/孔的密度接种在6孔板中，并孵育24小时。将细胞分为以下几组：对照组中仅与培养基一起孵育的细胞，以及在50.0 g/mL或100.0 g/mL芦。

25、荟中预处理 24h后暴露于40.0 M HPT 1h的细胞。对照组，仅与培养基一起孵育的细胞；伤害组，在50.0 g/mL或100.0 g/mL芦荟中预处理24h后暴露于40.0uM HPT 1h的细胞。 HPT处理1小时后，用冷PBS洗涤细胞并收获，根据以前发表的方法通过碱性彗星电泳测试细胞DNA损伤。用荧光显微镜(Leica Microsystems公司，德国韦茨拉尔/Wetzlar,Germany)检测彗星。通过彗星图像分析系统(Globalebio公司，中国北京)分析其图像。总强度(DNA含量)、尾巴长度、尾巴中的DNA百分比和尾矩这几个特征被用于评估。

26、DNA损伤的程度。 0062 9.细胞周期分析 0063 将细胞以4.0105/孔一式两份地接种在6孔培养板中，并与指示浓度的HPT，芦荟或组合物(包括组合物1和组合物2)孵育48小时。然后收获它们，并在4下用70(v/v)的冷乙醇固定过夜。通过离心收集固定的细胞，重新悬浮于PBS中，并与5mg/mL的碘化丙啶 (Sigma-Aldrich)和10mg/mL的核糖核酸酶A(Sigma-Aldrich)在室温下黑暗条件中孵育30 分钟。然后用流式细胞仪(MuseTM cell analyzer,Merck Millipore，德国达姆施塔特/ Darmstadt,Germa。

27、ny)分析细胞。最后，使用Modfit软件(Verity Software House，美国)计算不同阶段(G0/G1、 S和G2/M)的细胞百分比。 0064 10.凋亡检测 0065 使用MuseTM Annexin V&Dead Cell Kit(德国达姆施塔特/Darmstadt,Germany) 对细胞凋亡进行定量。通过胰蛋白酶消化得到HPT组，芦荟组或组合组(包括组合物1和组合物2)细胞，用冷PBS洗涤两次后重悬于1FBS中。加入MuseTM Annexin V&Dead Cell对细胞染色，然后通过流式细胞仪(MuseTM cell analyzer,Mer。

28、ck Millipore，德国达姆施塔特/ Darmstadt,Germany)进行分析。 0066 11.蛋白质印迹分析 0067 收集每组细胞，并在RIPA缓冲液中进行提取和裂解(Cell Signaling Technologies公司，美国马萨诸塞州贝弗利/Beverly,MA,USA)。使用Bradford试剂(Bio- Rad Laboratory,加利福尼亚州赫拉克勒斯/Hercules,CA,USA)测定蛋白质浓度。简而言之，将细胞裂解液与5x SDS上样缓冲液(4:1， v/v)混合,并盖紧盖子在100下加热5分钟。将这样处理过的裂解物(20 g)进行10十。

29、二烷基磺酸钠道-聚丙烯酰内胺凝胶电泳(SDS- PAGE)。电泳后，将来自SDS-PAGE的细胞提取物转移至硝酸纤维素膜(Merck Millipore，美国)，与Wnt/ -Catenin激活靶标抗体样品试剂盒#8655(稀释比1： 1000； Cell Signaling Technology)、兔 -Catenin(稀释比1:1000； Cell Signaling Technology)、鼠gamma H2A.X(phospho S139)9F3(稀释比1:1000；英国剑桥)、兔Caspase-3抗体(稀说明书 5/9 页 7 CN 111773301 A 7 释比。

30、1:1000； Cell Signaling Technology公司，美国马萨诸塞州丹弗斯)、兔caspase-8 抗体(稀释比1:1000； Cell Signaling Technology)、兔caspase-9抗体(稀释比1： 1000； Cell Signaling Technology)、小鼠PARP抗体(稀释比1:1000；英国剑桥)、兔Bak抗体(稀释比1： 1000；英国剑桥)、小鼠Bax抗体(稀释比1:1000，英国剑桥)及 -Actin抗体(稀释比1:2000， Santa Cruz Biotechnology，美国加利福尼亚州)在4下过夜。在上述。

31、步骤之后，将其与HRP偶联抗体(稀释比1： 10000； Cell Signaling Technology)共同孵育1小时。通过增强的化学发光试剂(Invitrogen，英国苏格兰佩斯利)显示蛋白质谱带，使用Image J 1.46r软件(National Institutes of Health，美国马里兰州贝塞斯达)分析谱带。 0068 结果分析 0069 1.芦荟提物物的LC-MS/MS分析 0070 通过LC-MS/MS分析芦荟水提取物的成分。通过对比参考化合物，根据芦荟素A、芦荟素B、芦荟宁和芦荟苦素的保留时间和裂解方式，对其进行了鉴定。本申请中芦荟提取物。

32、中的芦荟A、芦荟B、芦荟宁和芦荟苦素作为标记物被进一步定量，它们的含量分别为 1249.0、 1080.0、 23.8和4.3 g/g。 0071 2.芦荟提取物联合HPT在HepG2细胞中发挥协同作用 0072 通过细胞毒性MTT(3-4,5-二甲基-2-噻唑-2,5二苯基四唑溴化物)试验测定芦荟的固有细胞毒性。用不同浓度的芦荟(0-200.0 g/mL)处理HepG2细胞不同的时间(24、 48、 72h)。 0073 图1中A表示用不同浓度的芦荟提取物(0-200.0 g/mL)处理HepG2细胞24、 48和72 小时后的细胞存活率，横坐标表示芦荟提取物的浓度，纵坐标表。

33、示细胞存活率，由图可知，芦荟提取物的浓度100.0 g/mL时对HepG2细胞无明显的毒性作用，即使作用较长时间，也无明显效果， 90以上的细胞能够存活。 0074 图1中B表示采用HPT单独处理或采用组合物1(10uM HPT和50ug/ml芦荟提取物)、组合物2(10uM HPT和100ug/ml芦荟提取物)处理48小时的细胞存活率；由图可知， HPT单独处理或采用组合物1、组合物2处理，会导致HepG2细胞的存活率降低，组合物处理后HepG2细胞的存活率更低， HPT和芦荟提取物具有协同增效的作用。 0075 图1中C表示各处理组细胞形成的菌落，培养皿1表示对照。

34、组，不添加芦荟提取物和 HPT，培养皿2表示用50ug/ml的芦荟提取物处理，培养皿3表示用100ug/ml的芦荟提取物处理，培养皿4表示用10uM的HPT处理，培养皿5表示用10uM的HPT和50ug/ml的芦荟提取物共同处理，培养皿6表示用10uM的HPT和100ug/ml的芦荟提取物共同处理；由图可知，对照组和芦荟提取物单独处理组，细胞生长良好，用10uM的HPT处理会影响细胞的生长，而组合物处理会明显影响细胞的生长。 0076 由图中D表示菌落形成试验中各组的细胞数形成菌落的细胞计数，横坐标为各处理组，纵坐标为细胞数，由图可知，芦荟-HPT组合显。

35、著降低了HepG2细胞的生长。 0077 通过组合指数(CI)方法评估芦荟提取物和HPT之间的相互作用，其中CI1分别表示协同作用，累加作用或拮抗作用。 HPT单独处理和组合物处理的IC 50值(最大抑制浓度的一半)和CI值如表1。由表中IC50和组合指数(CI)值可知，芦荟提取物和HPT在 HepG2细胞中有明显的协同作用。说明书 6/9 页 8 CN 111773301 A 8 0078 表1.芦荟提取物和组合物对HepG2细胞的细胞毒性评估 0079 DrugIC50CI value HPT41.58.0_ 50.0 g/mL Aloe+HPT(组合物1)10.42.9*0.。

36、4470.101 100.0 g/mL Aloe+HPT(组合物2)2.61.4*0.3110.001 0080 注： *P0.05， *P0.01，表示与HPT组有显著性差异。 0081 3.芦荟-HPT组合增加HepG2细胞的DNA损伤 0082 HPT是一种DNA合成抑制剂，可以抑制DNA拓扑异构酶，并在DNA复制过程中造成 DNA损伤。因此，由DNA链断裂引起的DNA损伤程度可反映HPT在癌细胞中的细胞毒性。为了便于DNA损伤分析，对经过不同处理的HepG2细胞进行彗星试验。 0083 图2中A为各组的彗星分析，通过荧光显微镜(原始放大倍数： 200)获得的彗星试。

37、验图像，图中分别为对照组，不添加芦荟提取物和HPT；用50ug/ml的芦荟提取物处理；用 100ug/ml的芦荟提取物处理；用40uM的HPT处理；用10uM的HPT和50ug/ml的芦荟提取物共同处理；用10uM的HPT和100ug/ml的芦荟提取物共同处理。由图可知，与对照组相比，单独采用芦荟提取物处理的组的尾值没有差异；单独40.0 M HPT组孵育1h后，能观察到HepG2细胞中的尾巴；在芦荟+HPT组合中可发现更长的尾巴。 0084 图2中B为尾巴值分析图，横坐标为各处理组，纵坐标为尾巴长度；图2中C为尾矩值分析图，横坐标为各处理组，纵坐标。

38、为尾矩值；由图可知，与对照组相比，单独采用芦荟提取物处理的组的尾值没有差异；单独40.0 M HPT组孵育1h后，能观察到HepG2细胞中的尾巴；在芦荟+HPT组合中可发现更长的尾巴长度和更高的尾矩值。 0085 图2中D为DAPI和H2AX在HepG2细胞中的免疫荧光染色(原始放大倍数： 400)，从左往右依次为DAPI、 H2AX和Merge成像(Merge为DAPI和H2AX的成像叠加)；免疫荧光染色结果显示，芦荟提取物与HPT组合可在HepG2细胞中以剂量依赖性方式增加H2AX的水平。 0086 图2中E为H2AX在蛋白印迹法中的表达，其中横向从左往右依次为对。

39、照组，不添加芦荟提取物和HPT；用100ug/ml的芦荟提取物处理；用15uM的HPT处理；用15uM的HPT和 50ug/ml的芦荟提取物共同处理；用15uM的HPT和100ug/ml的芦荟提取物共同处理。和单独的HPT组相比，采用HPT和芦荟提取物共同处理组(即组合物组)的H2AX蛋白水平明显更高。 0087 由图2可知，芦荟提取物与HPT对DNA损伤的协同作用与H2AX的累积程度有关。 0088 10-羟基喜树碱(HPT)是喜树碱衍生物，是拓扑异构酶I的特异性抑制剂，可在DNA 切割后与DNA和核拓扑异构酶I酶之间形成的可裂解复合物结合并使其稳定，从而防止DN。

40、A 重新密封并使可裂解复合物积聚。因此，可裂解的复合物阻碍了暂时性DNA单链断裂的修复并阻止了DNA复制，导致致命的DNA双链断裂，进而激活了内切核酸酶，引发了进一步的DNA 断裂并最终导致了细胞死亡。彗星试验(也称为单细胞凝胶试验(SCG)是一个检测单细胞 DNA链断裂的灵敏且快速的方法。彗尾的长度与破坏程度呈正相关，彗星试验的数据证明，尽管芦荟的单独使用对DNA损伤没有影响，但芦荟能够以剂量依赖的方式刺激HPT诱导的 DNA损伤。 0089 H2AX是一个分子量为14kD的基础组蛋白，也是H2组蛋白家族的成员。这种核蛋说明书 7/9 页 9 CN 1117733。

41、01 A 9 白是在细胞周期的G1和S期合成的，并对免疫球蛋白转换区域之间的重组有着重要作用。双链DNA断裂后， H2AX在139号丝氨酸上被磷酸化。采用所述组合物处理后，形成的H2AX增加，因此进一步说明表明芦荟提取物显著促进了HepG2细胞中HPT诱导的DNA双链断裂。本发明中芦荟提取物和HPT组合物对诱导HepG2细胞中DNA双链断裂具有协同增效的作用。 0090 4.芦荟+HPT对细胞周期阻滞的影响 0091 为了研究HPT对HepG2细胞的抗增殖作用是否由细胞周期阻滞触发，使用碘化丙啶 (PI)染色的流式细胞仪分析经芦荟提取物、 HPT单独处理以及组合物处理48小。

42、时后的细胞周期分布。 0092 图3为不同阶段的HepG2细胞百分比，横坐标为各组(分别为对照组，不添加芦荟提取物和HPT；用50ug/ml的芦荟提取物处理；用100ug/ml的芦荟提取物处理；用40uM的HPT处理；用10uM的HPT和50ug/ml的芦荟提取物共同处理；用10uM的HPT和100ug/ml的芦荟提取物共同处理)在不同时期，纵坐标为细胞百分比。 0093 细胞周期进程的失调和细胞凋亡是癌症的常见特征，由图3可知，与对照组相比， HepG2细胞暴露于HPT导致G0/G1期减少，同时G2/M期增加。经芦荟提取物和HPT联合处理的细胞， S期细胞的。

43、比例增加，而G2/M期细胞的比例减少。此外，与HPT单独处理组相比，经组合物处理后可引起G0/G1期显著积累和G2/M期显著消耗。结果表明，与对照组相比，芦荟提取物和HPT联合处理显著诱导HepG2细胞S期阻滞。 0094 5.芦荟-HPT诱导半胱氨酸蛋白酶依赖性凋亡 0095 为了鉴定HPT-芦荟的生长抑制作用是否是由凋亡引起的，通过Annexin V&Dead Cell双重试剂染色的流式细胞仪证实了凋亡的发生。 0096 图4中A为处理前后凋亡细胞的分布图，图中横坐标分别为各组(分别为对照组，不添加芦荟提取物和HPT；用50ug/ml的芦荟提取物处理组；用10。

44、0ug/ml的芦荟提取物处理组；用40uM的HPT处理组；用10uM的HPT和50ug/ml的芦荟提取物共同处理组；用10uM的HPT和 100ug/ml的芦荟提取物共同处理组)在早期、中期和晚期，纵坐标为细胞百分比。由图4中A 可知，暴露于HPT后(有或没有芦荟提取物)，早期和晚期凋亡细胞的百分比显著增加。因为半胱氨酸蛋白酶激活被认为是肿瘤细胞中常见的凋亡途径。蛋白印迹法被用于评估半胱氨酸蛋白酶在细胞凋亡中的功能作用。 0097 图4中B为通过蛋白印迹法分析评估PARP、 caspase-3、 caspase-9、 Cleaved- caspase-9和Bax的水平，。

45、 -肌动蛋白( -actin)用作负载对照，图中，横向依次表示采用对照组，不添加芦荟提取物和HPT；用100ug/ml的芦荟提取物处理；用15uM的HPT处理；用15uM 的HPT和50ug/ml的芦荟提取物共同处理；用15uM的HPT和100ug/ml的芦荟提取物共同处理。图4中C表示PARP、 Cleaved-PARP、 caspase-3、 caspase-9、 Cleaved-caspase-9和Bax的相对表达水平代表图，横坐标为各组的PARP、 Cleaved-PARP、 caspase-3、 caspase-9、 Cleaved- caspase-9和Bax。

46、的相对表达，纵坐标为相对表达水平值。 0098 由图4中B和C可知，经芦荟提取物+HPT共同处理细胞中的PARP、 caspase-9和Bax明显降低，而Cleaved-PARP、 Cleaved-caspase-9和caspase-3被强烈激活。这些结果证实芦荟提取物可以通过半胱氨酸蛋白酶依赖性机制促进HPT诱导的细胞凋亡。 0099 6.芦荟-HPT组合物抑制HepG2细胞中的WNT/ -catenin通路 0100 为了进一步了解芦荟和HPT协同作用的机理，通过蛋白印迹实验研究WNT/- 说明书 8/9 页 10 CN 111773301 A 10 catenin信号通路蛋。

47、白。 0101 图5中A为通过蛋白印迹法评估WNT/ -catenin通路中的蛋白质水平图，将 -actin 作为负荷对照，图中横向依次为对照组，不添加芦荟提取物和HPT；用100ug/ml的芦荟提取物处理；用15uM的HPT处理；用15uM的HPT和50ug/ml的芦荟提取物共同处理；用15uM的HPT和 100ug/ml的芦荟提取物共同处理，纵向为各蛋白；图5中B为WNT/ -catenin通路蛋白的相对表达水平图，横坐标为各组(对照组，不添加芦荟提取物和HPT；用100ug/ml的芦荟提取物处理；用15uM的HPT处理；用15uM的HPT和50ug/ml。

48、的芦荟提取物共同处理；用15uM的HPT和 100ug/ml的芦荟提取物共同处理)的Met、 -catenin、 c-Jun、 c-Myc癌基因、 MMP7蛋白，纵坐标为相对表达水平值。 0102 典型WNT通路的抑制导致 -catenin向细胞核转运的停止，并抑制了核TCF/LEF转录因子的活性，从而破坏Wnt依赖性信号传导中的靶基因，包括CD44、 cyclin D1、 c-Jun、 LEF1、 Met、 MMP-7、 c-Myc和TCF1/TCF7。由图5中A、 B可知，该芦荟提取物和HPT组合物有效诱导了Met、 -catenin和c-Myc表达蛋白水平的下调；同。

49、时共同作用后，原癌基因c-Jun蛋白的表达水平呈剂量依赖性上调。该芦荟提取物和HPT组合物的协同增效作用与细胞WNT/ - catenin信号通路的调节有关，该组合物能够抑制HepG2细胞中的WNT/ -catenin通路。说明书 9/9 页 11 CN 111773301 A 11 说明书附图 1/7 页 12 CN 111773301 A 12 图1 说明书附图 2/7 页 13 CN 111773301 A 13 说明书附图 3/7 页 14 CN 111773301 A 14 图2 说明书附图 4/7 页 15 CN 111773301 A 15 图3 说明书附图 5/7 页 16 CN 111773301 A 16 图4 说明书附图 6/7 页 17 CN 111773301 A 17 图5 说明书附图 7/7 页 18 CN 111773301 A 18 。