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靶向真菌分子伴侣Hsp110的抑制剂设计

来源：花匠小妙招时间：2024-12-17 18:20

白色念珠菌(Candida albicans)是一种机会性病原体，可引起各种真菌感染（念珠菌病），范围从鹅口疮到念珠菌血症，这是最普遍的播散性血流感染之一（死亡率超过40%）。目前只有三类针对两种独特途径（麦角固醇和细胞壁）的抗真菌药物可用于治疗念珠菌病，而这些可用抗真菌药物的耐药性正急剧上升。作为白色念珠菌中唯一分子伴侣Hsp110（Msi3），它对于白色念珠菌在人类宿主中的生存、生长和感染至关重要。人类和真菌 Hsp110之间的序列保守性相对较低（<40% 同源性）。因此，Hsp110 Msi3可能是设计新颖有效且副作用较少的念珠菌病治疗药物的有利靶标。然而，此前没有关于任何真菌 Hsp110抑制剂的报道。最近，中南大学湘雅药学院以及深圳湾实验室分子生理研究所等多个团队合作，设计发现了真菌 Hsp110 Msi3的第一个抑制剂Compound 2H 。

前期研究发现，Msi3对ATP有高亲和力结合，并且这种结合受Msi3的核苷酸结合域（nucleotide-binding domain, NBD）与底物结合域（substrate-binding domain, SBD）两个功能域之间的变构偶联控制，直接破坏ATP与核苷酸位点的结合或影响变构偶联的化合物分子均可抑制ATP与Msi3结合。根据这一模式，可能具有三种模式的调节剂抑制ATP结合：1）与 ATP结合的直接竞争，2）变构偶联的直接调节抑制ATP结合，3）通过影响SBD活性间接影响变构偶联抑制ATP结合，且后两种模式由于变构位点的多样性，对Msi3具有潜在的特异性。

研究人员首先使用ATP-FAM（一种荧光标记的 ATP）建立了荧光偏振测定的筛选方法，通过对化合物库的筛选，发现了四种可以降低ATP与Msi3的化合物（结合减少了50%以上），其中Compound 2H抑制ATP 结合程度最高，因而作为进一步研究的重点。 100 µM的2H处理可使 Msi3对ATP的亲和力降低了约6倍，2H对 Sse1（来自酿酒酵母的主要 Hsp110）也表现出类似的抑制作用；与之对应的是，2H对ATP-FAM与Hsp105的结合几乎没有影响，并对ATP-FAM与酿酒酵母Ssa1（酵母中主要的细胞溶质Hsp70）的结合没有显着影响，体现了2H的较好选择性，提示2H可能不是ATP的竞争性抑制剂，而是一类新型的真菌Hsp110特异性抑制剂。进一步研究显示，2H在308 nm（λem = 432.3 ± 1.8 nm）激发时表现出强烈的荧光光谱，添加Msi3不仅将2H光谱的荧光强度提高了1.63 ± 0.20倍，而且还将光谱移动到更短的波长，表明2H与Msi3是可以直接的结合。同时，Msi3与ATP孵育进一步增加了2H的荧光强度，而单独的 ATP对2H的光谱几乎没有变化，表明2H必须在ATP存在的情况下结合Msi3，再次明确2H不是通过直接结合核苷酸结合位点，而是变构调控了ATP或底物与Msi3的结合。

Msi3具有两种整体构象：ATP结合和ADP结合/无核苷酸 (apo) 状态。胰蛋白酶消化实验表明，2H处理对Msi3在ATP结合时的变构偶联影响很小；相反，100 µM 2H孵育Msi3将其对底物的亲和力降低了近9倍，提示2H对ATP的抑制作用主要由于其降低了Msi和底物的结合力。这种模式不同于先前发现的Hsp110抑制剂（通过直接与 ATP竞争核苷酸结合位点），是一种新颖的抑制Msi3模式。

作为 Hsp110，Msi3具有两种已知的体外伴侣活性：防止蛋白质聚集（即保持酶活性）和协助Hsp70进行蛋白质折叠。为了检测2H的功能，研究人员以荧光素酶作为模型底物，通过变性和聚集实验发现，2H 对荧光素酶或单独的 Msi3 的聚集几乎没有影响，而几乎完全消除了Msi3 酶活性；与 Hsp70-Hsp40 伴侣孵育时，Msi3依赖性复性活性在2H处理后被有效消除，再次说明2H对Msi3功能的抑制。

在抑菌实验中，2H与氟康唑可以显著抑制野生型白色念珠菌SC5314生长，MIC 90（90%抑制的最低抑制浓度）皆为25 µM，分数抑制浓度指数（FICI）为0.91 ± 0.03，且 2H和氟康唑之间没有观察到明显的协同作用。此外，2H 浓度在高于25 µM时，可有效抑制生物膜形成。在机制方面，他们发现2H可以特异性地抑制蛋白折叠，而氟康唑对荧光素酶再折叠的影响很小。

综上，通过高通量筛选和机制验证，研究人员发现了真菌 Hsp110 Msi3的第一个抑制剂2H，它不仅通过新的变构模式消除了 Msi3 的分子伴侣活性，而且还强烈抑制了白色念珠菌的生长和活力，揭示了抑制 Hsp110的分子机制和开发新型抗真菌药的重要性，也为真菌 Hsp110 Msi3作为新靶标开发各种真菌感染的特异性和有效药物奠定了首创先导基础。

参考文献

3. Wang, Y. et al. Purification and biochemical characterization of Msi3, an essential Hsp110 molecular chaperone in Candida albicans. Cell Stress Chaperones 26, 695–704 (2021).

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