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RAP基因的应用以及改变草莓果实颜色的育种方法与流程

来源：花匠小妙招时间：2024-12-14 09:25

本发明涉及草莓育种技术领域，具体的，涉及rap基因的应用以及改变草莓果实颜色的育种方法。

背景技术：

草莓(fragariaananassa)为蔷薇科草莓属多年生草本植物，具有丰富的营养价值，位居世界小浆果生产之首。果实色泽是草莓育种的重要目标之一，而花青素是草莓果实变红的主要色素。植物细胞以苯丙氨酸为前体，在细胞质中经多步酶促反应合成花青素并储存于液泡中。花青素生物合成受两类基因的控制，分别称为结构基因和调节基因，其中结构基因在花青素合成途径中编码了一系列生物合成酶，且合成途径在各物种中非常保守，大致分为以下阶段：第一阶段前体苯丙氨酸在苯丙氨酸解氨酶(pal)、肉桂酸-4-羟化酶(c4h)、4香豆酰辅酶a连接酶(4cl)的作用下转化成4-香豆酰coa；第二阶段是4-香豆酰coa和丙二酰coa在查尔酮合成酶(chs)、查尔酮异构酶(chi)、黄烷酮3-羟化酶(f3h)和黄烷酮3’-羟化酶(f3’h)的作用下合成二氢黄烷醇；第三阶段是在二氢黄酮醇还原酶(dfr)、花青素合成酶(ans)、类黄酮糖基转移酶(ufgt)的作用下生成花青素。其中黄酮醇合酶(fls)作为一个分支途径可将二氢黄烷醇形成黄酮醇，无色花色素还原酶(lar)和花青素还原酶(anr)可催化原花青素的形成。

花青素合成途径的结构基因主要受到调节基因在转录水平上的调控，其中研究最透彻的是r2r3-myb转录因子、bhlh转录因子和wd40重复蛋白三者组成的复合体，称为“mbw”(myb-bhlh-wd40)复合体。例如，r2r3-myb转录因子myb10在苹果、桃、油桃、樱桃和梨中均调控了果实颜色。在草莓中，多篇文章证实fa/fvmyb10是正向调控果实颜色的关键转录因子，并且fvmyb10与fvbhlh33可能形成复合体促进结构基因的转录。最新研究发现因自然突变引起fvmyb10第12位氨基酸从w变为s，导致不同草莓生态型间红果(如ruegen)和白果(如yellowwonder、hawaii4)的差异。具体来说，野生型白果森林草莓‘yellowwonder’(yw)和‘hawaii4’(h4)均有红色叶柄、淡黄色的果皮、白色的果肉和瘦果；相反，野生型红果森林草莓‘ruegen’具有红色叶柄、红色的果皮、白色的果肉和红色的瘦果，且果皮和瘦果着色是从果实发育后期的转色期开始的。对于fvemyb10来说，ruegen是一个真正的野生型，而yellowwonder相当于该基因的缺失突变体。

除受合成途径的调控外，花青素的修饰和运输也直接影响了花青素最终的积累水平。花青素的稳定性受到糖基化、甲基化和乙酰化等修饰的调控。花青素在细胞质合成后需要运输到液泡中储存，因此花青素的运输也是调控花青素积累的重要环节。以玉米zmmrp3为代表的mrp，以拟南芥tt12为代表的mate，以及谷胱甘肽s-转移酶(gst，glutathiones-transferase)都具有运输花青素的作用。不同物种中的gst蛋白都可作为搬运蛋白(carrier)介导花青素的运输过程，如矮牵牛的an9基因、玉米的bz2基因以及拟南芥的tt19基因，其功能缺失后植株所有组织的花青素含量都显著下降。在桃中，gst编码基因riant调控了桃花杂色。此前，luoetal.，通过enu诱变yellowwonder获得一个具有绿叶叶柄的突变体rap，但它实际上是rapmyb10双突变体。基因克隆结果表明rap编码gst蛋白，是草莓营养器官和果实着色的关键转运蛋白。现有结果表明，在草莓果实成熟过程中，fvemyb10诱导花青素合成酶和rap基因大量表达，从而引起花青素积累，使果实着色；据此推断在fvemyb10缺失情况下，由于花青素合成受阻，rap基因过表达也不会使白果草莓着色。

技术实现要素：

发明人意外地发现将rap基因连接到过表达载体pk7wg2d上，并稳定转化于rap基因突变的白果森林草莓突变体中，果实颜色变红。

基于此，本发明提供了rap基因过表达在改变草莓果实颜色中的应用，通过在白果草莓植株中过表达rap基因得到红果草莓。

进一步，所述草莓为森林草莓。

本发明还提供了一种改变草莓果实颜色的育种方法，包括在白果草莓植株中过表达rap基因的步骤。

进一步，具体步骤为在白果草莓的愈伤组织中过表达rap基因，并将所述愈伤组织培育成植株。

进一步，在白果草莓的愈伤组织中过表达rap基因的方法为：通过gateway反应将rap基因整合到过表达载体pk7wg2d中，并将整合有rap基因的过表达载体pk7wg2d-rap转入白果草莓的愈伤组织中。

进一步，通过农杆菌转化法将所述整合有rap基因的过表达载体pk7wg2d转入白果草莓的愈伤组织中。

进一步，所述草莓为森林草莓。

本发明的有益效果是：本发明提供了rap基因在草莓颜色育种中的新应用，并且利用rap基因的过表达开发了一种促进草莓果实着色的新方法。

附图说明

图1为本发明不同森林草莓的植株、花和心皮的形态，其中(a)、(b)(c)、(d)分别为yw5af7、rap、rap-ox；rap和ruegen的植株、花和心皮的形态，其中心皮的标尺为20μm，图(e)为rap以及rap-ox；rap叶柄的表皮和横切图；

图2为本发明不同森林草莓果实照片，其中(a)、(b)(c)、(d)分别为yw5af7、rap、rap-ox；rap和ruegen成熟果实的表型，标尺为3mm；

图3为本发明yw5af7、rap、rap-ox；rap和ruegen的叶柄以及果实中花青素的含量图；

图4为本发明yw5af7和rap-ox；rap叶柄和果实中花青素的hplc色谱图，其中图4(a)为叶柄中花青素的色谱图，图4(b)为果实中花青素的色谱图，其中x轴表示时间，y轴表示在510nm处的吸光度，峰1为矢车菊素-3,5-二葡萄糖苷，峰2为芍药素-3,5-二葡萄糖苷，峰3为矢车菊素-3-葡萄糖苷，峰4为天竺葵素-3-葡萄糖苷，峰5为芍药素-3-葡萄糖苷，峰6为矢车菊素衍生物，峰7为天竺葵素衍生物，峰8为芍药素衍生物，峰9未知；

图5为rap-ox；rap和ruegen不同发育阶段花或果实的颜色，其中图5(a)ruegen不同发育阶段花和果实的纵切图，图5(b)rap-ox；rap不同发育阶段花和果实的纵切图，其中分别有阶段9(s9)、10(s10)、12(s12)及开花期(anthesis)、授粉后第6天(6d)、第10天(10d)、第13天(13d)及转色期(turning)的果实，比例尺分别为250μm(s9，s10，s12，anthesis)，1mm(6d，10d，13d)及1cm(turning)；

图6为在yw5af7果实中瞬时过表达rap后果实的颜色，其中图6(a)为在yw5af7果实中注射缓冲液的对照组,图6(b)为在yw5af7果实注射含有rap过表达载体的农杆菌重悬液；

图7为rap-ox；rap和ruegen植株开花期和转色期的转录组分析结果，其中图7(a)为venn图显示rap-ox；rap和ruegen果实转色期与开花期(s1)相比的上下调基因数量，图7(b)为在开花期(s1)rap-ox；rap与ruegen相比上调和下调的基因数量，foldchange>2,padj<0.05，图7(c)为rna-seq数据显示rap和其他7个花青素生物合成相关基因的表达水平，其中ruegen-s1代表ruegen的开花期，rap-ox；rap-s1代表rap-ox；rap的开花期，ruegen-turning代表ruegen的转色期，rap-ox；rap-turning代表rap-ox；rap的转色期。

具体实施方式

以下结合附图及具体实施例对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，如sambrook等分子克隆实验手册(sambrookj&russelldw，molecularcloning:alaboratorymanual,2001),或按照生化试剂制造厂商的说明书建议的条件。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径获得。

本发明中使用的植物材料为：

野生型白果森林草莓(yellowwonder，yw5af7，nationalclonalgermplasmrepository:corvallis,or,usa,idpi641092)；

野生型红果森林草莓(ruegen，nationalgermplasmrepositoryidpi666609)；

对野生型白果森林草莓的rap基因突变得到的突变体rap，其rap基因的第245位核苷酸由c突变为t，导致rap提前终止，无法表达rap蛋白。该突变体rap是由本实验室中通过enu诱变得到，也可以通过基因编辑方法获得rap基因突变的突变体rap。

用于实验的材料均在温度为22℃，光照为100μmolm-2s-1，光周期为16hlight/8hdark的植物培养间中生长。

rap基因编码一种谷胱甘肽s-转移酶(gst)，其为将合成的花青素从细胞质转移到液泡中的载体蛋白，其核苷酸序列如seqidno:1所示：

atggtactgaaagtttatggtccagttagggcagcctgcccccagagggtgatggtttgccttttggagctaggggttgagtttgagattgtgcctgttgatcttcaagcaggagagcaaaagcaacctcacattcttgctcgacaggtaaatattaacagtctagcaacataattgcatcaaattacacacacatacatgtcggcatatatttgactgtttgattaatttgcagccatttgggcaagttccagcaatcgaagatggcgatttcaagctttttggtatggggggatgatatgcatacatacatatacttgttactttcttaatttgggtcttttttggaagtccatgaaaaaagtagtccttgcaaaaatggcaataacaatatcagcagttgaaattgtgaaccaagtccaaaatgttattgataattggttatcaagagattaactagctaggtataactagtatagtaatactgtacgtatcttggaataagatgttcaaagttcttgttgctgtatgccttcattaacccgatttctggctctcgctctgctacacagaatctagagctatcgtaagatactatgcggctaagtatgcagagcgtggtcctaacctgctaggaacaacactggaggagaaggcactggtggatcaatggctcgaagtcgaatcacacaacttcaacgacttggttttcactgtggtacttcaacttgtgatccttcccagcatgggccaacctggcgacttggccttggtgcgctcttgtgaagaaaaactgaaaaaggtattcgatgtgtatgaggagagactgtccaagagcacctatctggccggaaactacttcagtttggctgatctgagccatcttccggcgattcggtttctggttgacgagttcaaaatgggacatttgatcacggagaggaagaatgtgaatgcttggtggaaagatatttccaataggcctgcatggaagaaacttatgaagcttgctcaatactag

其中标下划线的为内含子。

1、rap基因过表达载体构建

过表达载体构建：使用生工rna提取试剂盒(b518661-0050，生工)提取野生型红果草莓ruegen嫩叶的rna,然后通过反转录试剂盒(primescripttmrtreagentkitwithgdnaeraser)将rna反转录成cdna，以ruegencdna为模板在rap基因的开放编码框两端设计引物并加上接头序列，扩增引物为：

b1-gene31672-f:ggggacaagtttgtacaaaaaagcaggctatggtactgaaagtttatggt(seqidno:2),

gene31672-rfp-r:aggaggccatgtattgagcaagcttcataagt(seqidno:3)

扩增rap的cds序列(扩增体系为：kodplusbuf5μl、dntp5μl、mgso43.5μl、primer15μl、primer25μl、kodplus1μl、dmso2.5μl、ddh2o18μl、模板cdna5μl，反应条件：94℃5min，94℃35s，60℃35s，68℃xmin，68℃5min，4℃5min)，通过overlappingpcr与rfp融合，rfp扩增引物序列为：

gene31672-rfp-f:tgctcaatacatggcctcctccgaggacgtc(seqidno:4)、

b2-rfp-r：ggggaccactttgtacaagaaagctgggtttaggcgccggtggagtggcgc(seqidno:5)

扩增片段总长1434bp，使用cycle-purekit(omega)试剂盒纯化融合片段，通过bp反应(反应体系：pcr产物10ng、pdonr221中间载体质粒80ng、bp酶0.6μl、1×tebuffer补齐至3μl反应条件：25℃反应2h)将片段整合到中间载体pdonr221(质粒提取采用omega的plasmidminikiti试剂盒)上，通过pcr(引物f:atggtactgaaagtttatggt(seqidno:6)、引物r:gtattgagcaagcttcataag(seqidno:7)，大小642bp，反应程序：2×estaqmastermix9μl、ddh2o5μl、primer11μl、primer21μl、模板2μl，反应条件：95℃5min，95℃30s，55℃30s，72℃3min，72℃7min，4℃5min)、xbai和kpni-hf酶切(反应体系：cutsmart1μl、xbai(酶1)0.3μl、kpni-hf(酶2)0.3μl、plasmid5μl、ddh2o补齐至10μl，反应条件：37℃水浴3h)、测序(用擎科公司引物m13-f测序)鉴定阳性菌。通过lr反应(反应体系：rap-pdonr221中间载体质粒50ng、pk7wg2d终载体质粒50ng、lr酶0.6μl、1×tebuffer补齐至3μl，反应条件：25℃反应2h)将片段整合到过表达载体pk7wg2d(质粒提取采用omega的plasmidminikiti试剂盒)中，得到rap基因过表达载体pk7wg2d-rap，通过pcr(采用seqidno:6所示的引物f和seqidno:7所示的引物r)，大小642bp)验证、xbai酶切(反应体系：cutsmart1μl、xbai0.6μl、plasmid5μl、ddh2o补齐至10μl，反应条件：37℃水浴3h)验证后提取质粒转到农杆菌株gv3101(维地生物cat#：ac1001)中，pcr阳性鉴定(采用seqidno:6所示的引物f和seqidno:7所示的引物r)，大小642bp)后保存备用。

2、农杆菌介导的草莓稳定转化与鉴定

下列步骤中用到的ms为购自北京西美杰的m404murashige&skoogmodifiedbasalmediumwithgamborgvitamins(phytotech，m404-100l)。其中1/2ms为添加量为说明书指示浓度的1/2。

采用农杆菌介导的森林草莓愈伤组织转化法，具体操作步骤如下：

1)无菌苗的准备

将突变体rap的种子放入试管中，加入无菌水，放入冰箱，4℃浸泡过夜，次日，吸去无菌水，加入70％酒精浸泡5min(摇晃)，用无菌水冲洗4-5次，将酒精去除干净，用2％的次氯酸钠，加一滴tween20，浸泡10min(摇晃)，用无菌水冲洗3-4次，将种子播在含1/2ms培养基(1/2ms2.22g/l+蔗糖20g/l+琼脂7g/l，ph5.8)的培养皿上，在4℃下暗培养两周后转移到组培间发芽，当叶子长出2片真叶时移到1/2ms的瓶子中备用。

2)培养愈伤组织

在超净台中，用剪刀将无菌苗的叶片剪下，放在灭菌的空皿上，用手术刀切成若干小片(每小片叶子切3次)，放到5++培养基(ms4.44g/l+蔗糖20g/l+琼脂7g/l+吲哚丁酸0.3mg/l+6-苄氨基嘌呤3.4mg/l，ph＝5.8)上，每板放20片左右，并且叶片正面朝下，22℃暗培养15-30d，直至切口长出愈伤组织。

3)准备菌液

蘸取-80℃保存的菌液于含有抗性的固体lb培养基(酵母膏5g/l+蛋白胨10g/l+nacl10g/l+琼脂15g/l+庆大霉素50μg/ml+利福平50μg/ml+壮观霉素50μg/ml)上，划线活化农杆菌，28℃培养2-3d，挑取单克隆抗体与4ml含有抗性的液体lb培养基(酵母膏5g/l+蛋白胨10g/l+nacl10g/l+庆大霉素50μg/ml+利福平50μg/ml+壮观霉素50μg/ml)中，28℃震荡过夜，pcr鉴定阳性菌液。

4)转化

将菌液倒入2ml离心管中，取3-4管，8000rpm离心2min，弃上清，取1mlco-buffer(ms4.44g/l+蔗糖20g/l,ph5.8)重悬菌液，加入到含有20mlco-buffer的三角瓶中，加入200μl浓度为50mg/ml的乙酰丁香酮(as)溶液，室温遮光摇3h后，加入3板愈伤组织，室温遮光轻摇0.5-1h，用无菌水清洗愈伤组织2-3次，用镊子夹到滤纸上，将水吸干，放到5++培养基上，叶片正面朝下，放入培养箱，遮光共培养3d。

5)清洗愈伤组织

共培养3d后，部分愈伤组织附近产生农杆菌，将愈伤组织夹到含有无菌水的三角瓶中，清洗2-3次，用滤纸吸干水分，放到ct培养基(ms4.44g/l+蔗糖20g/l+琼脂7g/l+吲哚丁酸0.3mg/l+6-苄氨基嘌呤3.4mg/l+羧苄青霉素250mg/l+特美汀250mg/l,ph5.8)上，放入培养箱黑暗处理1周后转到正常培养条件培养(培养箱：光照16h，22℃，黑暗8h，19℃)。

6)继代培养

在ct培养基上培养2周后，将愈伤组织转到抗性培养基(ms4.44g/l+蔗糖20g/l+琼脂7g/l+吲哚丁酸0.3mg/l+6-苄氨基嘌呤3.4mg/l+羧苄青霉素250mg/l+特美汀250mg/l+卡那霉素5mg/l,ph5.8)上，以后每2周至一个月换一次培养基，直至愈伤分化出芽。

7)生根培养

愈伤产生芽后，将芽从组织上切下，转移到生根培养基(1/2ms2.22g/l+葡萄糖20g/l+琼脂7g/l+吲哚丁酸0.1mg/l+羧苄青霉素200mg/l+特美汀200mg/l+卡那霉素5mg/l,ph5.8)上培养，直至生根。

8)阳性苗鉴定

采用抗性培养基和gfp荧光筛选阳性愈伤和再生苗，小苗生根后种到土里，按照株系编号，采取嫩叶提取dna，通过以卡那抗性基因引物kam-f和kam-r、gfp基因引物gfp-f和gfp-r以及目的基因引物rap-f和rap-r进行pcr鉴定得到稳定转化rap基因的阳性苗。其中成功在突变体rap中过表达rap基因的植株为rap-ox；rap。

其中kam-f、kam-r、gfp-f、gfp-r、rap-f和rap-r的核苷酸序列如下所示：

kam-f：tcagaagaactcgtcaagaaggcg(seqidno:8)

kam-r：ggctgctattgggcgaagt(seqidno:9)

gfp-f：ggcaagctgaccctgaagttcat(seqidno:10)

gfp-r：ttgtggcggatcttgaagttcacc(seqidno:11)

rap-f：如seqidno:6所示

rap-r：如seqidno:7所示

3、实验数据测定

1)形态观察

分别对野生型白果森林草莓yw5af7、野生型红果森林草莓ruegen、突变体rap和在突变体rap中过表达rap基因得到的植株rap-ox；rap的表型进行观察，结果如图1所示，其中yw5af7具有红叶叶柄，白色花瓣和淡黄色心皮，rap的叶柄为绿色，而在突变体rap中过表达rap基因得到的植株rap-ox；rap可以恢复野生型红色叶柄的表型，同时，rap-ox；rap出现叶片有一些红褐色斑点和每个心皮的柱头变红的新表型，更进一步观察表明，rap-ox；rap的叶柄表皮以及维管束及其周围花青素分布显著增加，表明rap基因过表达可以恢复突变体rap中器官的着色，并导致心皮柱头变红。

由于在野生型白果森林草莓yw5af7中，其fvmyb10发生突变导致花青素无法合成，因此yw5af7以及rap中果肉的颜色均为白色，在突变体rap中过表达rap后，预期果实颜色无法变红。但是对野生型白果森林草莓yw5af7、野生型红果森林草莓ruegen、突变体rap和在突变体rap中过表达rap基因得到的植株rap-ox；rap的果实颜色进行观察，结果如图2所示，rap-ox；rap的果实成熟后，花托表皮和果肉均变红，且色泽与ruegen的红色不同。另外，ruegen果实成熟后花托表皮和瘦果虽为红色，果肉却呈白色，这与rap-ox；rap的果实颜色具有明显差异。

2)花青素含量测定

分别取野生型白果森林草莓yw5af7、野生型红果森林草莓ruegen、突变体rap和在突变体rap中过表达rap基因得到的植株rap-ox；rap的新鲜草莓果实以及叶柄为样品，测定样品中花青素的含量。

花青素含量的具体测定方法为：用液氮将0.5g样品研磨至粉末状，加入5ml提取液(甲醇：水：甲酸：三氟醋酸＝70:27:2:1)，4℃冰箱中避光浸提12h，上清液用滤纸粗滤后备用，用紫外分光光度计(hoefervision，sp-2001)检测滤液在530nm和657nm处的吸光值，花青素含量＝(a530–0.25*a657)/m，其中a530和a657分别指530nm和657nm的吸光值，m指果实或叶柄鲜重(zhangetal2009)。每个样品有三个生物学重复，显著性差异采用ibmspssstatistis22软件分析，p<0.05。

其中叶柄中花青素的含量如图3(a)所示，其中rap-ox；rap与rap相比，叶柄中的总花青素含量显著增加，与形态观察结果一致。

果实中花青素的含量如图3(b)所示，其中rap-ox；rap果实的花青素含量显著高于yw5af7或rap，但低于ruegen，表明rap基因过表达的植株rap-ox；rap果实中花青素的积累并不依赖于myb10。

3)花青素组分分析

分别取ruegen和在突变体rap中过表达rap基因得到的植株rap-ox；rap的新鲜草莓果实以及叶柄为样品，测定样品中花青素组分。

具体的测定方法为：用液氮将0.5g样品研磨至粉末状，加入2.5ml盐酸甲醇溶液(甲醇：水：盐酸＝80:20:0.1)，4℃冰箱中避光浸提12h，取上清液于新的离心管中，10000rpm4℃离心20min，采用0.45μm的微孔滤膜过滤，放在棕色进样瓶中备用，采用develosil-odsc18柱(5μm，4.6mm*250mm)，daojinglc-20at高效液相色谱仪进行检测，色谱条件：流动相a：1％甲酸水；流动相b：甲醇。进样量为20μl，流速为0.6ml/min。流动相b的线性梯度：0—10min，10％—25％；10—15min，25％—30％；15—50min，30％—50％；50—60min，50％—60％；60—68min，60％—10％；68—70min，10％。扫描波长：510nm。标准品为矢车菊素(aladdin,27661-36-5)。

其中叶柄中的花青素组分如图4(a)所示，叶柄中rap-ox；rap与ruegen的花青素组成成分相同，均含有芍药素-3,5-二葡萄糖苷(峰2)、矢车菊素-3-葡萄糖苷(峰3)和芍药素-3-葡萄糖苷(峰5)，但这三种物质在rap-ox；rap叶柄中的含量有所增加。

在果实中，ruegen含有丰富的矢车菊素-3-葡萄糖苷(峰3)和天竺葵素-3-葡萄糖苷(峰4)，而芍药素-3-葡萄糖苷(峰5)含量较低，与此相反，rap-ox；rap的果实具有较高的矢车菊素-3-葡萄糖苷(峰3)和芍药素-3-葡萄糖苷(峰5)，而天竺葵素-3-葡萄糖苷(峰4)含量很低。这些结果表明rap过表达改变了果实中花青素的组成。

4)花青素积累时间测定

分别观察rap-ox；rap和ruegen不同时期的花和果实的形态，根据hollender,c.a.,geretz,a.c.,slovin,j.p.andliu,z.(2012)flowerandearlyfruitdevelopmentinadiploidstrawberry,fragariavesca.planta235,1123-1139这篇文章将草莓花发育从分生组织到花期分为13个连续的阶段，分别为s1-s13，根据fait,a.,hanhineva,k.,beleggia,r.,dai,n.,rogachev,i.,nikiforova,v.j.,fernie,a.r.andaharoni,a.(2008)reconfigurationoftheacheneandreceptaclemetabolicnetworksduringstrawberryfruitdevelopment.plantphysiology148,730-750将草莓后期果实发育分为绿熟期、白熟期，转色期、粉熟期和红熟期5个阶段。

结果如图5所示，ruegen花的心皮和花托呈现黄色，在转色期时瘦果和花托皮才开始变红，而rap-ox；rap的心皮柱头在第9时期之前就变红了，授粉6天后果实花托积累大量的花青素，由于观察rap-ox；rap在果实发育后期花托颜色不会加深，我们预测在果实发育后期，花青素不再产生。

为了验证上述假设，将rap过表达载体pk7wg2d-rap通过农杆菌瞬时转化到yw5af7白熟期的果实中，具体操作步骤如下：

①蘸取-80℃保存的pk7wg2d-rap农杆菌液于含有抗性的固体lb培养基(酵母膏5g/l+蛋白胨10g/l+nacl10g/l+琼脂15g/l+庆大霉素50μg/ml+利福平50μg/ml+壮观霉素50μg/ml)上，划线活化农杆菌，28℃培养2-3d，挑取单克隆到6ml含有抗性的液体lb(酵母膏5g/l+蛋白胨10g/l+nacl10g/l+庆大霉素50μg/ml+利福平50μg/ml+壮观霉素50μg/ml)，28℃震荡培养过夜，直到菌液od达到0.8-1.0；

②取2ml菌液到离心管中，5000rpm离心5min；

③用含有2％蔗糖的液体ms(ms4.44g/l+蔗糖20g/l,ph5.8)重悬菌液，使菌液od值达到0.8；

④选择白熟期果实，用1ml注射器吸取菌液，注射到果实中，1ml菌液可注射5-8个果实，做好标记，注射后一周左右观察结果。

⑤每个基因注射10个以上的果实。

观察果实颜色的变化，结果如图6所示，直至成熟果实仍不会变红，表明花青素在发育后期没有产生。

4)分子水平花青素积累

为研究rap-ox；rap果实花青素积累的分子机制，分别取ruegen和rap-ox；rap开花期的花托和转色期果实进行rna-seq并进行差异表达分析，具体实验方法为：使用rna提取试剂盒(生工)分别提取rap-ox；rap和ruegen开花期和转色期果实(包括花托和心皮)的rna，每个样品有三个生物学重复，每个生物学重复都含有3-6个果实，采用pe150方法构建rna序列库并采用illuminahiseqxten进行序列测定。在2-pass模式下使用star程序将每个样品中的数据(大约8g)比对到f.vesca基因组并使用v2.0.a2注释。featurecounts用于计算每个基因的读取次数。差异表达基因通过rpackagedeseq2分析。

结果如图7(a)所示，转色期与开花期相比，ruegen中有4831个基因上调，6534个基因下调；rap-ox；rap中有4470个基因上调，6177个基因下调，共同上调的基因有3787个基因，下调的基因有5442个基因，这表明两种材料在果实发育过程中的转录情况相似。

由于在开花期rap-ox；rap与ruegen花托的颜色不同，我们比较了rap-ox；rap和ruegen在开花期花托的基因表达水平，结果如图7(b)所示，与ruegen相比，rap-ox；rap中只有453个基因显著上调，363个基因下调。

由于果实的颜色发生变化，我们分析了花青素生物合成途径中的结构基因的表达水平，发现在ruegen中，与开花期相比rap在转色期时大量表达。此外，由于35s组成型启动子载体表达rap，导致在rap-ox；rap中的rap表达水平更高，与发育阶段无关。

随后，对开花期与花青素合成相关的15个结构基因(pal1、pal2、c4h、4cl1、4cl2、chs1、chi、f3h、f3'h、dfr2、ans、ufgt、fls、lar、anr)的表达水平进行分析发现与ruegen相比这些基因在rap-ox；rap果实中的表达水平均未超过2倍，表明花青素生物合成途径处于非活跃状态。

此外，由于缺乏功能性fvemyb10，与ruegen相比rap-ox；rap在转色期时果实中有7个基因显著下调，结果如图7(c)所示，且花青素调控基因fvemyb10和fvebhlh3的表达水平没有显著变化。

相关基因的表达水平如下表所示：

rna-seq显示花青素途径基因的表达水平。表达值由rna-seq三个生物学重复中获得的平均tpm表示。

本发明实施例中，为了在白果森林草莓中过表达rap基因，采用了野生型白果森林草莓的rap基因突变得到的突变体rap作为实验材料，野生型红果森林草莓ruegen花的心皮和花托呈现黄色，在转色期时瘦果和果皮开始变红，花青素开始积累；而在突变体rap(rapmyb10双突变体)中过表达rap基因后，心皮柱头在第9时期之前已经变红，授粉6天后果实花托积累大量的花青素，果实发育后期，花青素不再产生，且在果实中ruegen与rap-ox；rap的花青素组成不同，ruegen含有丰富的矢车菊素-3-葡萄糖苷和天竺葵素-3-葡萄糖苷，芍药素-3-葡萄糖苷含量较低，而rap-ox；rap的果实具有较高的矢车菊素-3-葡萄糖苷和芍药素-3-葡萄糖苷，而天竺葵素-3-葡萄糖苷含量很低。这些结果表明，rap-ox；rap果实在未成熟前即可变红，且花青素的积累不依赖myb10，这不同于野生型红果草莓ruegen着色机制。证明在野生型白果森林草莓yw5af7中过表达rap基因，也可以改变果实的颜色，因此rap可作为草莓颜色育种中的候选基因，且为花青素形成机制的研究提供了新的思路。本发明提供了rap基因在草莓颜色育种中的新应用，并且利用rap基因过表达开发了一种促进草莓果实着色的新方法。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。